犬细小病毒病诊断技术国家标准.pdf

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1、资料参考Information·Reference犬细小病毒病诊断技术国家标准1范围2.12蛋白酶K贮备液。4.2.3胃空虚，黏膜轻度潮红，本标准规定了犬细小病毒病的2.135×TBE电泳缓冲液。附有大量黏液；小肠壁增厚，肠管临床检查、血凝与血凝抑制试验、3器材和设备变粗，肠腔狭窄，形成厚层黏膜皱PCR检测的操作方法。3.1PCR仪。褶，易于剥落，肠腔内充满紫红色本标准适用于犬细小病毒病的3.2高速台式冷冻离心机：可粥样内容物并混有血凝块。鉴定及其流行学调查、诊断和监测。控温至4℃、离心速度可达12000g4.3判定其中病毒分离、血凝与血凝抑制试以上。若临床症状符合4.1.1或4.1.2

2、验、PCR检测适用于犬细小病毒的3.3水平电泳仪。且出现4.2.1或4.2.3的病理变化，病原诊断。3.4凝胶成像系统。则可判定疑似犬细小病毒病，其他2试剂和材料4临床检查临床症状和病理变化可作为参考指2.1FK81细胞（猫肾细胞）。4.1临床特征标；疑似病例可采用血凝与血凝抑2.20.9%生理盐水。4.1.1潜伏期1周到2周，病制试验或PCR检测进行确诊。2.31%猪红细胞液。初无任何症状，食欲减退或废绝，5血凝与血凝抑制试验2.4犬细小病毒阳性血清。体温40℃以上，粉红色黏稠血样物。5.1血凝试验（HA）的操作方2.596孔“v”形微量反应板。4.1.2病犬先出现呕吐，呕吐法2.6T

3、aq酶及10倍Taq酶反出白色泡沫或黄色液体，继而腹泻，5.1.1样品采集活犬的泪液、应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μL，-粪便稀薄而恶臭，剧烈的腹泻呈喷鼻液、粪便，病死犬的肝、脾、肺20℃保存。射状，粪便呈红色，混有大量黏液等组织器官。将待检组织或粪便2.71.5mLEppendorf管。或假膜。后期排番茄汁样稀便，并样品加等体积生理盐水研磨匀浆，2.80.2mLPCR薄壁管。有特殊的腥臭味。3000g离心15min，收集上清液待检；2.9dNTP:含dCTP、dGTP、4.1.3患犬迅速消瘦，倦卧不口腔拭子、粪拭子用少量生理盐水dATP、dTTP各10mmol/L，-20℃保存。起，

4、目光呆滞，眼窝下陷，腹围紧缩，浸润后，取上清液待检。2.10引物：浓度为20μmol/L，机体脱水，皮肤干燥、弹性降低。5.1.2在96孔“v”形微量反应其序列如下：4.2病理变化板上进行，自左至右各孔加50μL上游引物（CPVF）：5’GAATCT4.2.1心脏肿大呈灰黄色，切理盐水。GCTACTCAGCCACCAAC3’；面外翻，质地松软，心肌有出血性5.1.3于左侧第1孔加50μL下游引物（CPVR）：5’GTGCAC斑纹。待检样品混合均后，吸50μL至第TATAACCAACCTCAGC3’。4.2.2肝脏肿大，包膜紧张，2孔，混合均匀后，吸50μL至第2.1110%十二烷基硫酸钠

5、：配多呈黄褐色，质地松软有局灶性坏3孔，依次倍比稀释，至第11孔，制参见附录A。死，断面有豆蔻状花纹。吸弃50μL，稀释后病毒稀释度为662012·07中国工作犬业资料参考Information·Reference第1孔1∶2，第2孔1∶4，第3毒为犬细小病毒。2.5μL、dNTP0.5μL、Taq酶0.5μL、孔1∶8⋯⋯最后12孔为对照。6PCR检测DNA模板2μL、上游引物和下游引5.1.4由左至右依次向各孔6.1病料的采集及处理物（CPVE、CPVR）各0.5μL、三蒸加1%猪红细胞悬液50μL置微采集的样品包括犬的泪液、鼻水18.5μL，配制PCR检测体系。型混合器上振荡，使血

6、球与病液、唾液、粪便及病死犬的肝、脾、将PCR管置PCR仪上按如下程序扩毒充分混合，在37℃温箱中作用肺等组织器官。将待检组织或粪便增：首先94℃变性2min；再94℃、15min~30min后，待对照红细胞已样品加等体积生理盐水研磨匀浆，30s，55℃、30s，72℃、40s进行沉淀可观察结果。3000g离心15min，收集上清液待35个循环；最后72℃、3min。用5.1.5判定结果：以100%凝集检。口腔拭子、粪拭子用少量生理TBE电泳缓冲液配制1.5%的琼脂（血球呈颗粒性伞状凝集沉于孔底）盐水浸润后，取上清液待检。经细糖平板（含0.5μg/mLEB），将平板的病毒最大长稀释孔为该

7、病毒血凝胞病原分离培养的样品，收集细胞放入水平电泳仪，使电泳缓冲液刚价，即一个凝集单位，不凝集者红沉淀待检。CPV阳性对照样品和阴好没过胶面，将10μLPCR产物和细胞沉于孔底呈点状。性对照样品的同样处理。2μL加样缓冲液（6X），混匀后加入5.2血凝抑制试验（HI）的操6.2DNA抽提样品孔。在电泳时设立DNA标准分作方法取上清液465μL，加入25μL子量作对照。5V/cm电泳约30min，5.2.1根据HA试验结果，确10%十