GBT27533-2011-犬细小病毒病诊断技术.pdf

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1、ICS11．220B41a亘中华人民共和国国家标准GB／T27533--2011犬细小病毒病诊断技术Diagnostictechniquesforcanineparvovirusdisease2011-11-21发布2012-03-01实施宰瞀鹳紫瓣警矬赞星发布中国国家标准化管理委员会促19标准分享网www.bzfxw.com免费下载刖罱GB／T27533--2011本标准的附录A和附录B为资料性附录。本标准由中华人民共和国农业部提出。本标准由全国动物防疫标准化技术委员会(SAC／TC181)归口。本标准起

2、草单位：青岛农业大学动物科技学院、中华人民共和国上海出入境检验检疫局。本标准主要起草人：单虎、温建新、熊炜、黄娟、秦晓冰、于鹏程。标准分享网www.bzfxw.com免费下载犬细小病毒病诊断技术GB／T27533--20111范围本标准规定了犬细小病毒病的临床检查、血凝与血凝抑制试验、PCR检测的操作方法。本标准适用于犬细小病毒病的鉴定及其流行病学调查、诊断和监测。其中病毒分离、血凝与血凝抑制试验、PCR检测适用于犬细小病毒病的病原诊断。2试剂和材料2．1FK81细胞(猫肾细胞)。2．20．9％生理盐水：配

3、制参见附录A中A．1。2．31％猪红细胞液：配制参见附录A中A．2。2．4犬细小病毒阳性血清。2．596孔“v”形微量反应板。2．6Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5u／pL，--20℃保存。2．71．5mLEppendorf管。2．80．2mLPCR薄壁管。2．9dNTP：含dCTP、dGTP、dATP、dTTP各10mmol／L，--20℃保存。2．10引物：浓度为20pmol／L，其序列如下：上游引物(CPVF)：57GAATCTGCTACTCAGCCAAC37；下游引物(CPVR)

4、：5’GTGCACTATAACCAACCTCAGC3’。2．1110％十二烷基硫酸钠：配制参见附录A。2．12蛋白酶K贮备液：配制参见附录A中A．4。2．135×TBE电泳缓冲液：配制参见附录A中A．6。3器材和设备3．1PCR仪。3．2高速台式冷冻离心机：可控温至4℃、离心速度可达120009以上。3．3水平电泳仪。3．4凝胶成像系统。4临床检查4．1临床特征4．1．1潜伏期1周到2周，病初无任何症状，食欲减退或废绝，体温40℃以上，粉红色黏稠血样物。4．1．2病犬先出现呕吐，呕吐出白色泡沫或黄色液体，继

5、而腹泻，粪便稀薄而恶臭，剧烈的腹泻呈喷射状，粪便呈红色，混有大量黏液或假膜。后期排番茄汁样稀便，并有特殊的腥臭味。4．1．3患犬迅速消瘦，倦卧不起，目光呆滞，眼窝下陷，腹围紧缩，机体脱水，皮肤干燥、弹性降低。4．2病理变化4．2．1心脏肿大呈灰黄色，切面外翻，质地松软，心肌有出血性斑纹。4．2．2肝脏肿大，包膜紧张，多呈黄褐色，质地松软有局灶性坏死，断面有豆蔻状花纹。4．2．3胃空虚，黏膜轻度潮红，附有大量黏液；小肠壁增厚，肠管变粗，肠腔狭窄，形成厚层黏膜皱褶，易1标准分享网www.bzfxw.com免费下

6、载GB／T27533--201于剥落，肠腔内充满紫红色粥样内容物并混有血凝块。4．3判定若临床症状符合4．1．1或4．1．2且出现4．2．1或4．2．3的病理变化，则可判定疑似犬细小病毒病，其他临床症状和病理变化可作为参考指标；疑似病例可采用血凝与血凝抑制试验或PCR检测进行确诊。5血凝与血凝抑制试验5．1血凝试验(HA)的操作方法5．1．1样品采集活犬的泪液、鼻液、唾液、粪便，病死犬的肝、脾、肺等组织器官。将待检组织或粪便样品加等体积生理盐水研磨匀浆，30009离心15min，收集上清液待检；口腔拭子、粪

7、拭子用少量生理盐水浸润后，取上清液待检。5．1．2在96孔“v”形微量反应板上进行，自左至右各孔加100pL生理盐水。5．1．3于左侧第1孔加50pL待检样品于1．5mLEppendorf管，混合均匀后，吸50pL至第2孔，混合均匀后，吸50pL至第3孔，依次倍比稀释，至第11孔，吸弃50pL，稀释后病毒稀释度为第l孔1：2，第2孔1；4，第3孔1：8⋯⋯最后12孔为对照。5．1．4由左至右依次向各孔加1％猪红细胞悬液50pL置微型混合器上振荡，使血球与病毒充分混合，在37℃温箱中作用15min～30min

8、后，待对照红细胞已沉淀可观察结果。5．1．5判定结果：以100％凝集(血球呈颗粒性伞状凝集沉于孔底)的病毒最大稀释孔为该病毒血凝价，即一个凝集单位，不凝集者红细胞沉于孔底呈点状。5．2血凝抑制试验(m)的操作方法5．2．1根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配成4个血凝单位病毒溶液。5．2．2在96孔“v”形微量板上进行，用固定病毒稀释血清法，自第1孔至第10孔各加50pL生理盐水，11和12孔分别为4单位CPV