有参考基因组的转录组生物信息分析模板

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1、一、生物信息分析流程获得原始测序序列(SequencedReads)后，在有相关物种参考序列或参考基因组的情况下，通过如下流程进行生物信息分析：二、项目结果说明1　原始序列数据项目结果文件高通量测序(如illuminaHiSeqTM2000/MiSeq等测序平台)测序得到的原始图像数据文件经碱基识别(BaseCalling)分析转化为原始测序序列(SequencedReads)，我们称之为RawData或RawReads，结果以FASTQ(简称为fq)文件格式存储，其中包含测序序列(reads)的序列信息以及其对应的测序质量信息。测序样品真实数据随机截取展示FASTQ格式文件中每个read

2、由四行描述，如下：@EAS139:136:FC706VJ:2:2104:15343:1973931:Y:18:ATCACGGCTCTTTGCCCTTCTCGTCGAAAATTGTCTCCTCATTCGAAACTTCTCTGT+@@CFFFDEHHHHFIJJJ@FHGIIIEHIIJBHHHIJJEGIIJJIGHIGHCCF其中第一行以“@”开头，随后为illumina测序标识符(SequenceIdentifiers)和描述文字(选择性部分)；第二行是碱基序列；第三行以“+”开头，随后为illumina测序标识符(选择性部分)；第四行是对应序列的测序质量(Cocketal.)。illu

3、mina测序标识符详细信息如下：EAS139Uniqueinstrumentname136RunIDFC706VJFlowcellID2Flowcelllane2104Tilenumberwithintheflowcelllane15343'x'-coordinateoftheclusterwithinthetile197393'y'-coordinateoftheclusterwithinthetile1Memberofapair,1or2(paired-endormate-pairreadsonly)YYifthereadfailsfilter(readisbad),Notherwis

4、e180whennoneofthecontrolbitsareon,otherwiseitisanevennumberATCACGIndexsequence第四行中每个字符对应的ASCII值减去33，即为对应第二行碱基的测序质量值。如果测序错误率用e表示，illuminaHiSeqTM2000/MiSeq的碱基质量值用Qphred表示，则有下列关系：公式一：　Qphred　=　-10log10(e)illuminaCasava1.8版本测序错误率与测序质量值简明对应关系如下：测序错误率测序质量值对应字符5%13.1%2050.1%30?0.01%40I2　测序数据质量评估项目结果文件2.1

5、　测序错误率分布检查每个碱基测序错误率是通过测序Phred数值(Phredscore,Qphred)通过公式1转化得到，而Phred数值是在碱基识别(BaseCalling)过程中通过一种预测碱基判别发生错误概率模型计算得到的，对应关系如下表所显示：illuminaCasava1.8版本碱基识别与Phred分值之间的简明对应关系Phred分值不正确的碱基识别碱基正确识别率Q-sorce101/1090%Q10201/10099%Q20301/100099.9%Q30401/1000099.99%Q40测序错误率与碱基质量有关，受测序仪本身、测序试剂、样品等多个因素共同影响。对于RNA-se

6、q技术，测序错误率分布具有两个特点：(1)测序错误率会随着测序序列(SequencedReads)的长度的增加而升高，这是由于测序过程中化学试剂的消耗而导致的，并且为illumina高通量测序平台都具有的特征(ErlichandMitra,2008;Jiangetal.)。(2)前6个碱基的位置也会发生较高的测序错误率，而这个长度也正好等于在RNA-seq建库过程中反转录所需要的随机引物的长度。所以推测前6个碱基测序错误率较高的原因为随机引物和RNA模版的不完全结合(Jiangetal.)。测序错误率分布检查用于检测在测序长度范围内，有无异常的碱基位置存在高错误率，比如中间位置的碱基测序错

7、误率显著高于其他位置。一般情况下，每个碱基位置的测序错误率都应该低于0.5%。图2.1　测序错误率分布图横坐标为reads的碱基位置，纵坐标为单碱基错误率2.2　GC含量分布检查GC含量分布检查用于检测有无AT、GC分离现象，而这种现象可能是测序或者建库所带来的，并且会影响后续的定量分析。在illumina测序平台的转录组测序中，反转录成cDNA时所用的6bp的随机引物会引起前几个位置的核苷酸组成存在一定的偏好性。而这种