饱和硫酸铵纯化

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1、饱和硫酸铵纯化血清中抗体1实验原理此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。2实验试剂与器材2.1实验试剂：硫酸铵、氨水、盐酸、1XPBS溶液（PH7.4）、2%NaHCO3、1mmol/LEDTA(PH8.0)、1mol/LNaOH、氯化钡、蒸馏水2.2实验器材：磁力搅拌器、低温离心机、4℃冰箱、PH计、离心管、锥形瓶、搅拌棒、

2、量筒、烧杯、漏斗、移液器、电磁炉、铝锅、剪刀、试剂瓶、透析袋夹子2.3样品抗血清3实验步骤3.1配制溶液3.1.1配制饱和硫酸铵溶液，25℃时饱和溶解度是767g/L，0℃时为676g/L(见附表)。配制1000ml饱和硫酸铵，将800g左右的硫酸铵加入到1L水中，加热搅拌到大部分固体溶解，趁热过滤并室温冷却，仍会有晶体析出，再用氨水调节PH至8.5，4℃保存备用（可以根据所需量按比例调整所配溶液量）。3.1.2配制1XPBS溶液（PH7.4）取1.44gNa2HPO4（或3.63gNaHPO4.12H2O），0.24gKH2P

3、O4，8gNaCl，0.2gKCl，加入800ml水中，用盐酸调PH至7.4，补蒸馏水至1000ml，高压蒸汽灭菌。4℃保存。3.1.3配制2%NaHCO3，2gNaHCO3加入到100ml蒸馏水中。3.1.4配制1mol/LNaOH，4gNaOH慢慢加入80ml蒸馏水中，边加入边搅拌，完全溶解后定容至100ml，室温保存，无需除菌。注意放热反应，塑料烧杯储存。43.1.5配制1mmol/LEDTA(PH8.0)，先配储存液：EDTA(0.5mol/L)：Na2·EDTA·2H2O37.2g+20gNaOH配成大约80ml溶液（

4、注：液体+粉末混合体积会增加），再用NaOH溶液调节PH为8.0，定容至100ml，可以在水浴50℃中溶解。临用前稀释至1mmol/L。1.1透析袋处理3.2.1将透析管剪适当长度（20-30cm），即形成透析袋。3.2.2在2%（m/V）NaHCO3和1mmol/LEDTA(PH8.0)中将透析袋煮沸10min。3.2.3将透析袋用蒸馏水彻底漂洗。3.2.4将透析袋置于1mmol/LEDTA(PH8.0)中将透析袋煮沸10min。3.2.5将透析袋冷却，4℃存放备用，应确保透析袋始终浸没在液体中。3.3沉淀（此步在4℃下进行）

5、3.3.1抗血清离心去除细胞碎片，保留上清液测定体积，并加入等体积PBS溶液（PH7.4）稀释。3.3.2边搅拌便逐滴滴入等体积的饱和硫酸铵溶液，搅拌均匀使蛋白充分沉淀。3.3.3搅拌均匀后4℃静置1h，10000rpm/min离心20min，弃上清取沉淀。3.3.4PBS溶液（PH7.4）溶解沉淀。3.3.5继续向上一步蛋白溶液中滴入1/2体积的饱和硫酸铵溶液（饱和度达33%），搅拌均匀。3.3.64℃静置1h，10000rpm/min离心20min，弃上清取沉淀。3.3.7PBS溶液（PH7.4）溶解沉淀。3.3.8重复以上

6、步骤3次或进行亲和层析纯化，以得到纯度较高的产品。3.4透析（此步在4℃下进行）3.4.1取出备用的透析袋，用蒸馏水彻底漂洗干净。3.4.2一端封闭，检查有无漏液，如无漏液，将上一步制备的蛋白溶液转入透析袋中，用透析袋夹子最后封闭末端开口。3.4.3在PH7.4的1XPBS中透析12-24h（1:20），每3-6h换一次透析液，以彻底去除硫酸铵。检测硫酸铵去除是否彻底，可取少量样品加入10%氯化钡，如检测不到沉淀，即透析完毕。43.4保存分装到合适的离心管中，即时用可4℃保存，备用-20℃保存。硫酸铵饱和度的常用表1．调整硫酸铵

7、溶液饱和度计算表（25℃）硫整硫酸铵终浓度,%饱和度  10202530333540455055606570758090100每1升溶液加固体硫酸铵的克数①硫酸铵初浓度，%饱和度05611414417619620924327731335139043047251656166276710 578611813715018321625128832636540644949459269420  2959789112315519022526230034038242452061925   3049619312515819323026730734

8、839048558330    1930629412716219823527331435644954633     12437410714217721425229233342652235      31639412916420023817831941150640