生物化学与分子生物学实习指导

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1、生物化学与分子生物学实习指导实验一蛋片质含量测定（比色分析法和分光光度法）实验二从小鼠肝脏中提取DNA实验三DA酶解及DNA片段琼脂糖凝胶电泳实验四现代PCR技术实验五人血清抗胰蛋白酶（ai-AT）的分离及鉴定内容一盐析法，凝胶过滤法内容二纤维素离了交换层析，蛋白含量测定，酶活性测定內容三SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳內容四总结实验六酶的特异性、激动剂、抑制剂实验七温度、pH对酚促反应速度的影响实验八运动对尿屮乳酸含量的影响实验九肝糖原实验实验十肝脂质的提取及薄层层析实验一蛋口质含量测定（比色分析法和分光光度法）【冃的要求】1.

2、掌握比色分析法和分光光度法基本原理、标准Illi线的制作及使川，标准管法结果计算2.熟悉蛋白质含量测定常用方法、原理及应用3.了解常川可见光、紫外分光光度计的测定原理及使川【教学内容】1.酚试剂法蛋白质含量测定Lambert-Beer定律，比色分析法和分光光度法基木原理，722型分光光度计使用，常用蛋白质含量测定方法及应用，酚试剂法测定蛋口质含量原理、操作，标准Illi线的制备及使用2.双缩腺法蛋白质含量测定白学和独立完成实验并与酚试剂法比较，结果计算3.紫外分光光度法蛋白质含量测定紫外分光光度法测定蛋白质含量原理，方法，优缺

3、点，注意事项；国产752型紫外分光光度计使用，UV-260分光光度计使用，注意事项，波长扫描，标准曲线制作【实验原理】一、比色分析法许多物质木身具冇一定的颜色，也冇许多物质木身无颜色，在加入适当的显色剂后生成冇色物质。溶液浓度越人，颜色越深。因此可以利用比较溶液颜色深浅的方法来测定有色溶液的浓度。这种方法叫比色分析法。1.物质的颜色和波长：可见光：波长（x）400—760nm紫外光：A小于400nm红外光：X大于760nm橙!—W—光的互补示意图彳光的互补：将两种适当颜色的可见光按一定强度比例混合可得到口光，这两种光叫互补光,

4、该现象叫光的互补。单色光：口光通过棱镜后可分解成各种波长不同的色光，把具有一种波长，不能再分解的光叫单色光。2.溶液的颜色和光吸收的关系：溶液的颜色，是由于不同的冇色物质冇选择地吸收某种颜色的光而引起的。溶液呈现的颜色是与它主要吸收的光相互补的光的颜色。溶液吸收的光越多，呈现的颜色越深。例如：一束白光通过核黄索溶液，溶液呈黄色，是因为蓝色光被吸收，而其它颜色的光均为两两互补，透过光只多余出黄色光，所以核黄素溶液呈黄色。光吸收曲线：测定同一物质对不同波氏光线的吸收程度，以波氏为横坐标，光密度为纵坐标作图，所得曲线为光吸收曲线。3

5、.物质浓度，液层厚度与光吸收的关系（Lambert—Beer定律）：当一束单色光通过溶液后，光被溶液吸收的程度（D）与溶液的浓度（C）,液层的厚（L）以及入射光的强度（Io）冇关。溶液浓度越大，液层越厚，吸光越多，这就是物质（均匀透明固体，液体，气体）对光的吸收定律。关系式:T=I侷=10・kcl（1）°Lg.I/Io=-KCL-一―（2）“坡S/I=KCL（3）a光的吸收示意图T：透光率3b入射光强度QC：溶液浓度3L：液层厚度卩I：透过光强度algIo/I意义:当I二Io时，lgI。/1=0,表示溶液完全不吸收光线；当1<

6、1。时，lgIo/I值较人，表示溶液对光吸收较多；当1-0时，lgIo/I值无穷大，表示光线几乎被溶液完全吸收（溶液不透光）。由此可见，lgIo/I表示了溶液对光的吸收程度。表示方法：光密度OD或D（opticaldensity）吸光度A（Absorbance）消光度E（Extinction）于是，（3）式可写成：D=KCL公式中K为消光系数，K=D/CL,表示有色溶液在单位浓度和单位厚度时的吸光度。同一溶质，K值相同。百分消光系数：C=1%,L=lcm克分了消光系数：C=1克分了浓度，L=lcmD二KCL意义：物质对光吸收程

7、度与该物质的消光系数K,溶液浓度C,液层厚度L成正比。2.待测溶液浓度的讣算：（1）标准管法：在同样条件下，测得标准液和待测液的光密度（D）值，然示计算：标准液:Ds=KsCsLs待测液：Du=KuCuLu其屮，Ls=Lu,Ks=Lu,Ds/Du=Cs/CuCu=(Du/Ds)XCs(2)标准曲线法:分析大批待测样品时，采用此法较方便。先配制一系列浓度由小到大的标准溶液，测出它们的光密度(D)值。在一定浓度范围内，溶液浓度(C)与其光密度(D)之间呈肓线关系。以各管D为纵朋标，C为横处标，绘制标准曲线。待测溶液D值测出后，在曲

8、线上查出C。(3)标准系数法：多次测定标准溶液的光密度后求出平均值，标准系数=标准液浓度/标准液平均光密度，同法测出待测液的光密度代入下式：0二待测溶液光密度X标准系数(4)消光系数法：1%浓度，1cm厚度溶液中测得：K=Elemi%或1克分了浓度，1cm厚度溶液屮测得：K二