小鼠脾细胞原代培养,死活细胞鉴定

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1、小鼠脾细胞原代培养，死活细胞鉴定山东人学实验报告山东人学实验报告2013年6月8日姓名陈少坤系年级2011级生科2班同组者张劲松王洪善科冃细胞实验题冃小鼠脾细胞原代培养，死活细胞鉴定一、刖R细胞培养的概念：多细胞生物的细胞可以被分离出来，然后在体外特殊培养环境中继续存活，并保持其生理、生化特性直接从生物体分离出來，在体外培养过程中尚未分裂、增殖的细胞，称为原代培养细胞。原代培养细胞在一泄条件下可以继续增殖，在数量上人量扩增，这时就成为继代培养细胞。细胞培养基要满足细胞的生长需要，包括pll、渗透压、营养和生长因子等，已保证细胞的增殖。细胞培养1I1L是特殊制造的使细胞可

2、以贴壁。细胞培养箱常指二氧化碳培养箱。它可以捉供合适的温度和二氣化碳浓度。二氧化碳和培养基屮的缓冲系统共同作用，保持细胞培养液的酸碱度。超净台通过将空气进行过滤，为细胞培养的各种操作提供了一个干净的环境，使细胞培养免于细菌和真菌的污染。细胞培养特点：大量实验材料单一、纯粹细胞类型培养基的成分口J控，即生长条件可控/全合成、无血清培养基易于观察易丁操作，改造活细胞必需通过控制物质进岀细胞膜來保持内部生理坏境的稳定性。细胞死后，细胞膜通透性发生改变，原先不能进入细胞的物质也能够进入细胞。台盘蓝染料正常情况下被活细胞阻拦在细胞膜外，只有细胞膜受损或者细胞死亡后，才能进入细胞。

3、因此，活细胞一•般不能被台盘蓝染色，而死细胞会被染成蓝色。伊红和苏木精是最帘用的细胞染色剂。山东人学实验报告山东大学实验报告二、实验目的回顾细胞培养的有关学习分离小鼠脾细胞的技术学习悬浮细胞的计数学习简单的细胞培养技术学习实验过程的详细描述及实验记录三、实验用品试剂：小鼠，70%酒精，蒸饰水，PBS,细胞培养液，台盘蓝，伊红溶液仪器解剖盘，蹑子，剪子，盖玻片，载玻片，显微镜，吸管，血细胞计数器四、实验步骤一、原代培养1.采川颈椎脱臼的方法牺牲小鼠。2.将小鼠浸泡在70%酒精中几分钟。3.将小鼠平放在解剖盘内，腹部向上。用銀子夹起下腹部毛皮，用剪子剪一个横向小口，然后用手

4、用两边撕开，暴露肌肉层。或者用剪子向斜上方剪一个V字开口。将肌肉层向斜上方剪一个V字开口，向上翻开，暴露腹腔。4.在腹腔左上方，将冒拨开，暴露出后方的暗红色、扁平、长条状的脾。将脾剪下，放入玻璃平皿中。5•注射器中加入0.2mlPBSo将L-型针头沿脾的纵轴插入脾中，注射PBS后，脾将涨人，颜色变浅。*注意，不要扎穿脾6.用针头在脾上扎一些孔，然后冇针头的沿水平方向挤压，刮擦脾，使脾细胞从小孔中样放到PBS溶液中。最后脾由暗红色变成黄白色，而PBS溶液变红。将脾的残骸丢掉。山东大学实验报告Cournirtggrid(ceraralarea)山东犬学实验报告6.将混有细胞

5、的PBS用吸管吹打数次，使细胞团分散为单个细胞。8•将细胞悬液转至微离心管中，加PBS至lml,500g离心5分钟。9.弃去上清，将细胞沉淀1ml细胞培养液悬浮后，用移液枪取200"的细胞培养悬浮液加至事先加有lml培养液的细胞培养皿中。10.单向摇晃培养皿，使细胞均匀分散开。11.在细胞培养箱中培养一到两个星期。二、死活细胞记数1•先用肉眼，然后用显微镜观察培养的细胞。2.敲打培养皿，使贴壁细胞释放出來。旋摇培养皿，使细胞充分悬浮。2.取0.5ml细胞悬液，分别加入一滴台盘蓝，或1.5ml伊红。轻轻混合后，室温下染色二分钟。3.在计数器上盖上盖玻片。4.将细胞悬液滴在

6、计数器两边V字形槽内。细胞悬液依毛细作用扩散到计数区。5.在镜下计数。取屮间和四个角上的屮等方格，计数每个方格内死活细胞的数量。细胞浓度（个/ml）二5个中等方格内的细胞总数X5X10X稀释倍数。注意：当遇到位于大格线上的细胞，一般只计数人方格的上方和右方线上的细胞五、实验记录4培养一周Z后山东大学实验报告山东人学实验报告死活细胞鉴定死细胞活细胞左上中格209左下中格4111中间中格236右上中格3311右下中格4010山东大学实验报告山东大学实验报告记：由于培养的细胞人多死亡，故在做第二步死活细胞鉴定吋，是将培养细胞和培养好的活细胞按照人约体积2:1的比例混合后进行观

7、察的。六、实验结果计算细胞浓度=194X5X10=9.6X10个/ml七、总结1、取小鼠脾时注意保持其完整，注入缓冲液要慢而准月.适量，不要撑破脾脏，保证细胞分散游离岀來。2、培养液PH为7.0〜7・4,其小加有酚軌，止常状况细胞生长过程代谢物使PH下降，培养液的颜色改变呈黄色，因此可通过培养液颜色变化初步判断细胞生长状况。3、生长状况良好的细胞膜和核完整，细胞质透明，而细胞质出现较多颗粒状或空泡证明细胞衰老。除游离期和衰退期外细胞一般贴壁&氏。游离期细胞一般圆形，折光率高，而衰退期细胞皱缩，透明度下降，立体感很差，较易区分。4、倒置显微