四)液相色谱柱子使用及保养-0702

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1、液相色谱实用技术色谱柱的使用和保养色谱柱的选择非极性或极性较小的样品可用一般的C18柱酸碱性的化合物建议选用填料经封尾钝化过的C18柱，PH范围2-9（12）糖类，氨基酸，有机酸，多环芳烃，GPC有专用柱键合相色谱柱以硅胶为基质，通过化学键合方式把碳十八、碳八、胺基等基团联在基质上作为固定相。这种固定相要占所有柱填料的60-70%优点∶固定相稳定，不易流失应用广泛，可使用多种溶剂消除硅羟基的不良影响缺点∶pH值不能小于2或大于8同样填料，各种牌号色谱柱不尽相同反相HPLC柱（C18）的性能常规C18填料的稳定性硅胶基质填料pH范围：2-8pH值大于7

2、时键合相粉碎或溶解pH值小于2时键合相的化学键断裂经常用缓冲液固定相降解填料新的键合技术-PH范围2-12-稳定性好，使用寿命长良好的色谱实验习惯拿到一根新色谱柱时，先测柱效保留在新色谱柱上测得的色谱图，并记录条件定期检测柱效色谱柱的使用及操作流动相的转换特别是GPC柱流速(压力)的变化幅度温度的变化幅度专用色谱柱∶样品及溶剂的要求色谱柱的保养（一）样品方面除去微粒及杂质了解样品在流动相中的溶解度如样品的溶剂不是流动相，一定要用流动相试溶解度，防止其在流动相中析出了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用样品准备为什么溶剂和样品要过滤?溶剂和样品过滤非

3、常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。样品过滤头的类型：30mm内径：适用于大进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料有纤维素,醋酸纤维,聚四氟乙烯。处理样品体积少于50μl。13mm内径：适用于范围广的过滤，由0.2μm和0.45μm两种规格,材料为纤维素。3mm内径：适用于小进样量的过滤，由0.2μm和0.45μm两

4、种规格。处理样品体积为7μl。色谱柱的保养（二）流动相方面除去微粒纯度的要求超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验）缓冲液的pH值，在填料的允许范围内缓冲液（盐）的浓度溶剂：色谱纯，并与填料相匹配溶剂中的杂质含量注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂流动相对样品的溶解度有机溶剂或水的比例溶剂过滤-除去微粒不干净的溶剂或在溶剂瓶中长菌的溶剂会阻塞溶剂过滤器以及色谱柱。遵从下列建议可以提高性能，延长溶剂过滤器和色谱柱的寿命：?使用无菌溶剂瓶避免溶剂长菌。?用滤膜过滤溶剂去除微生物。?每两天更换或过滤溶剂。?避免溶剂瓶直接日照。?向溶剂中加入0

5、.0001-0.001M的叠氮化钠。溶剂准备：过滤选择合适的滤膜聚四氟乙烯滤膜：适用于所有溶剂，酸和盐，并无任何可溶物。醋酸纤维滤膜：适用于水基溶剂，不适用于有机溶剂，推荐用于蛋白质和其相关的样品。尼龙66滤膜：适用于绝大多数有机溶剂和水溶液，可用于强酸、70%乙醇、二氯甲烷、不适用于DMF二甲基甲酰胺再生纤维素滤膜：具有蛋白质吸收低，同样适用于水溶性样品和有机溶剂。注意：1）每张滤膜只能用一次。2）水相和有机相不要搞混。溶剂的相溶性溶剂信息避免使用下列对不锈钢有腐蚀性的溶剂：?卤化物碱金属溶液和相应的酸溶液。?高浓度的无机酸例如：硝酸和硫酸。?能够形成

6、卤素自由基或酸的氯化试剂及其混合物。?含有过氧化物的色谱级醚必须用氧化铝干燥剂。?在有机溶剂中的有机酸溶液。?含有强络合剂的溶液。?四氯化碳和异丙醇或THF混合液。溶剂截止波长溶剂准备：脱气流动相使用前为什么要脱气？流动相使用前必须进行脱气处理，以除去其中溶解的气体（如O2），以防止在洗脱过程中当流动相由色谱柱流至检测器时，因压力降低而产生气泡。气泡会增加基线的噪音，造成灵敏度下降，甚至无法分析。溶解的氧气还会导致样品中某些组份被氧化，柱中固定相发生降解而改变柱的分离性能。若用FLD，可能会造成荧光猝灭。常用的脱气方法比较：氦气脱气法：利用液体中氦气的溶

7、解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好，但成本高。加热回流法：效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染抽真空脱气法：易抽走有机相。超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果最差。在线真空脱气法：LC真空脱机利用膜渗透技术，在线脱气，智能控制，无需额外操作，成本低，脱气效果明显优于以上几种方法，并适用于多元溶剂体系。典型的流速流动相的保存有机溶剂流动相:室温下密封,避光保存缓冲盐流动相:当日现配现用低温下密封保存,一般不超过3天防止长菌有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:低温密封保存防止有机相的挥发选用适宜的容器2星期1天1星期

8、1小时新鲜配制5101520250分保存于聚乙烯瓶中的超纯水测试条件水样:40m