病原菌生物学论文

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1、病原菌生物学论文病原菌生物学论文预读：摘要:1材料与方法L1实验方法1.1.1病原菌的分离和致病性测定采集新近腐烂的百合鳞茎，采用纽织分离法［11］在病健交界组织处切取4mmx4mm小块，用75%酒梢表而消毒30s,再用2%次氯酸钠消毒7min,无菌水冲洗3次，然后置于PDA培养基上28°C黑暗培养，待Kill菌丝后，挑取菌落边缘进行纯化，纯化示的菌落再进行单砲分离培养•病原菌致病性测定根据柯赫氏法则，用火菌的接种针在消毒后的鳞茎片上刺孔，将浸有菌液的滤纸片贴在孔上作为有伤接种，同时将浸有菌液的滤纸片贴在耒刺孔的鳞茎片上作为无伤接种，将浸无菌水的滤纸片贴在孔上作为对照.接种处理完成后将鳞茎片

2、置于培养111L屮保湿培养,5d示观察并记录发病悄况,确定病原菌对百合鳞茎的致病性.对接种发病的鳞茎片再次进行病原菌的分离.1.1.2病原菌鉴定L121病原菌形态学观察将病原菌接种到PDA平板,28°C黑喑培养2・5d,观察菌落形态，并在显微镜下观察病原菌的菌丝及他子的形态特征，测量他子大小.1.1.2.2ITS序列分析将供试菌株接种于PDA培养基屮；28°Cfu温培养4d,收集菌丝体，采用CTAB法提取病原菌基因组DNA.ITS通用扩增引物为TS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3?)和TS4(5'・TCCTCCGCTTATTGATATGC-3').扩增体系:50&micr

3、o;L,棊因纽.模板DNAlµL、10µmo1/L上下游引物各lµL、2mmol/LdNTPs5µL、KODDNA聚合酶1µL、10xKODbuffer5µL,加ddH20补足体积.PCR扩增反应程序为94°C预变性3min；94°C变性30s；58C复性30s；72°C延伸3min,35个循环；72°C延伸lOmin.扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，由北京信诺金达生物技术有限公司测序.所得测序结果在NCBI网站上用BLAST软件进行同源性比较后，下载同源序列，用MEGA(molecularevolutionaryg

4、eneticsanalysis,Version6.0)软件将病原菌ITS序列与同源序列进彳亍比对，并采丿IJ邻接法(Neighboijoining,NJ)构建系统发育树，自举法(bootstrap)对系统发冇树进行检验,500次重复.1」.3病原菌生物学特性将直径5mm的病原菌菌块分别接种于供试培养棊平板(直径9cm)屮央，于培养箱屮培养，分析培养基种类、碳源、氮源、温度、pH和光照时间对病原菌菌丝生长和产砲量的影响採用PDA、PSA、PMA、LA和LDA培养基；培养温度分别为5、15、25和35°C；pH分别为5、6、7、8和9；全光照、全黑暗和光照/黑暗各12h；等量葡萄糖、果糖、乳糖和

5、淀粉置换杏氏基木培养基屮的蔗糖，等量硫酸镀、硝酸钱、硝酸钾和蛋白腺，置换杳氏基本培养基屮的硝酸钠，并设空口对照•病原菌菌株Z1和Z2分别在以上各条件下培养5d、2d后(因菌株Z2生长速度较快，因此缩短培养吋间统计菌落生长状况)，釆用十字交叉法测量菌落生长直径作为菌丝牛•长状况指标,7d后采用血球计数板法测量砲子产量.1.2数据分析采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析,Duncan氏新复极差法检验处理间差异显著性.显著水平p=0.05,每个处理3个重复.2结果与分析2」刁合鳞茎腐烂病症状及致病性兰州冇合鳞茎腐烂病的发生一般从鳞茎表血破损处开始,初侵染时在破损处形成略显褐色的侵染点，逐

6、渐扩展形成近圆形或不规则形状的褐色病斑，病斑屮央呈腐烂状，并逐渐向四周扩人，病斑上可见灰绿色霉层，腐烂组织不断增加，严重时导致整个鳞茎软化腐烂.从兰州百合鳞茎腐烂病斑上分离纯化得到五株菌株，分别编号为Z1、Z2、Z3、Z4和Z5.致病性结果表明，仅菌株Zl、Z2单独接种健康百合鳞茎片后，在接种部位出现腐烂病斑，并伴随菌丝体大量繁殖，菌株Z2比Z1的侵染能力强，无伤接种也nJ导致鳞茎片腐烂(图l・b、c).菌株Z1和Z2混合接种鳞茎片后，使鳞茎片腐烂更为严重(图1-d)，其病症与百合鳞茎口然条件下的发病症状相同•从接种发病部位可分别重新分离到少接种菌相同的菌株,表明所分离到的菌株Zl、Z2均为

7、兰州冇合鳞茎腐烂病病原菌.2.2病原菌鉴定2.2.1病原菌形态从兰州百合腐烂鳞茎上分离到的病原菌菌株Z1,在PDA培养基上菌丝质地致密丝绒状，中央部分呈絮状，菌株形成少量菌核，同吋伴有渗出液（图2-a）；菌落反而为无色至淡褐色，后期产生菌核时，会显现黑褐色斑点（图2-b）；分生抱了头初为球形，后呈辐射形;分生砲子梗多生白基质，孑包子梗200〜800pmx8〜20屮壁厚，无色，粗糙；产砲结构为双层；分生孑包子为