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1、犬瘟热病毒DNA疫苗的实验免疫研究邱IT范泉水'李作生I郑颖I杨美峰1尹惠琼1王双印1夏咸杜2】成都军区联勤部军亭医学研究所2军*医学科学院军丰#医研究所犬瘟热病毒(Caninedistemperviz，CDV)属于副粘病毒科麻疹病毒属中的病毒，在世界上广泛分布，是当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危客最大的犬瘟热(Caninedistemper,CD)病原，该病发病率和死亡率都较高。CDV最初只感染犬，但近年来其自然感染的动物范围又不断扩大的趋势，能使许多野生动物和家养的动物发病山习。CDV有众多的白然感染宿主,又能在大童
2、的不相关动物种类中交叉感染,因存在种间传播,要消灭CDV是不容易的，其危害越来越大。犬瘟热的预防免疫主要是通过接种弱莓疫苗进行工动免疫。无论足进口疫苗还是其复制品或国内生产的疫苗，虽然有一定的效果，但都不能彻底控制CD的发生。而且现行的弱毒疫苗只有在幼犬体内的母源抗体完全消失后才能产生有效保护作用，但对某些动物来说弱彥苗的毒力仍然可引起致死性的总染，这对保护稀有动物来说是个难题。质粒DNA的肌肉内接种及其编码蛋白的后续表达为预防接种和基因治疗开辟了新的途径，我们正研究用DNA疫苗来预防CDV的可能性。CDV的H蛋白是诱导机体产生中和抗
3、体的主要蛋白之一，是抗CDV免疫的重要抗原，抗CDVH蛋白单克隆抗体(McAb)只有中利病毒活性，对实验鼠的保护率强于抗F蛋白的McAbI61o我们用真核表达载体构建了CDV血疑案蛋白(H)的重组质粒plRCDV-Ho研究表明plRCDV-H质粒免疫的犬能对CDV感染产生一定程度的保护。1材料与方法1.1试剂、质粒、细胞株及动物限制性核酸内切酶BamHI、Hind皿、Kleoow、EcoRV和T4DNA连接酶及病毒RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒均购白大连宝生物公司。plRES载体由本实验室保存。DNA胶回收试剂盒购自上海华舜生物
4、工程有限公司。大肠杆菌JM09感受态细胞由本实验室制备。猴，旨(Veto)细胞、CDV毒种由本实验室保存。5只混合饲养的CDV中和抗体效价W2的昆明犬为市售。1.2引物由上海生工合成，序列如下ATCTAGATGGACCrCAGGG-3*oPl5f-AAATCC-TATGTGAGA-3,：P251.3CDV病毒总RNA的提取及目的基因的RT-PCR用CDV弱毒疫苗株接种猴肾(Vero)细胞，培养5天后，细胞出现典型的CDV细胞病变，弃上清槪，用哝缩，用病毒RNA提取试剂盒提取RNA,操作按说明书进行。纯化的RNA部分用RT-PCR试剂盒
5、进行RT-PCR,其余了一20兀冻存备川。PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶上进行电泳。1.4目的片段的回收及克隆PCR产物电泳后用胶回收试剂食回收约1.9kb的日的片段，与丁载体连接,转化大肠杆菌JM109感受态细胞,涂布含50pg/ml氨节青霉素的LB平板,37=培养过夜，挑取单个菌落培养后抽提质粒并进行酶切鉴定，挑选反向插入的重组质粒pTCDV—H。1.5免疫质粒的构建和序列测定重组质粒pTCDV-H用HindBI酶切，再用Kleoow补RV双酶切的平,然斤用BamHI将H片段切下,经胶回收纯化H片段,再与用BamHIZplRES载
6、体闩收产物用T4DNA连接酶于16T连接过夜，转化JMJ09感受态细胞,涂布含50u/ml氨节肯霉素的LB平板,37弋培养过夜,挑取单个菌落培养后抽提质粒并进行酶切鉴定，阳性騷缩质粒命名为plRCDV-H。蚩组质粒由上海华舜生物工程有限公司进行核昔酸序列侧定，并与CenBank中的H基因序列进行比较。1・6免疫5犬混合饲养的9月龄犬分别接种每毫升含200.400.600^SOOugpIRCDV-H利800ugplRES的磷酸盐缓冲液(PBS,0.0067M,PH7.2),所有按种分别在左、心肢股四头肌处肌注。每隔8周在同样部位接种同样
7、剂量的DNA,共接种3次，每次接种前采血样检测效价。1・7抗体分析以纯化的CDVIgG为阳性对照，用ELBA测定抗CDVH蛋白抗体滴度.推测山待检血清的中和抗体(SN)效价。1.8攻毒为检测CDVH诱导的保护水平,在第三次接种4周后，用剂量为1X10"TCIDso/只的CDV神经株强毒,对全部实验犬进行攻毒实验，每天观察犬的发病情况,7天及14天时采血，检测血清效价。2结果2.1免疫质粒的构建用0.8%琼脂糖凝胶电泳,扩增片段约为1.9Kb,与理论值大小一一致。筛选到的重组质粒plRCDVH用BamHI酶切鉴定，用0.8%琼脂糖凝胶电
8、泳,得到约7.2Kb的正狮质粒片段，与预期大小相符(图l)o1、H基因的PCR严物;2、盧组质粒pIRCDVi—U
9、3.®粒pIRES;4^DNAl^erDU5000;S.at组质粒pIRCDV—H经Bunltl■切结果
