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1、ISSN1002-4956实验技术与管理第27卷第2期2010年2月CN11-2034/TExperimentalTechnologyandManagementVol.27No.2Feb.2010荧光光谱法在蛋白质研究中的应用尹燕霞,向本琼,佟丽(北京师范大学生命科学学院,北京100875)摘要:荧光光谱法对研究蛋白质结构及其构象变化是很重要的。描述了荧光光谱的概念、发光机理及特点,介绍了荧光光谱仪的仪器原理和结构,记述了荧光光谱技术在检测蛋白质的构象变化、蛋白质的含量和酶活性方面的具有应用。关键词:荧光光谱法;蛋白质;构象中图分类号:O657.3;TQ937文献标志码:A文章编号:10
2、02-4956(2010)02-0033-04TheapplicationofstudyingfluorescencespectroscopyonproteinYinYanxia,XiangBenqiong,TongLi(CollegeofLifeScience,BeijingNormalUniversity,Beijing100875,China)Abstract:Fluorescencespectroscopyisveryimportantforstudyingproteinstructureandconformationchanges.Theconceptandprincipleo
3、ffluorescencespectroscopyareintroducedatfirst,thentheapplicationofstudyingfluorescencespectroscopyonproteinisexplained.Keywords:fluorescencespectroscopy;protein;conformation1荧光光谱技术被消耗,所以荧光能量要比物质吸收的光能量小,因而荧光的发射波长总比激发波长长。某些物质被一定波长的光照射时,会在较短时间内发射出波长比入射光长的光,这种光称为荧光。荧光光谱在各方面的应用及有关的方法称为荧光光谱技术。1.1荧光发光机制
4、每一个分子具有一系列分离的电子能级,每一电子能级中又有一系列的振动能级和转动能级。当-15物质被光照射后,大约在10s内光被物质吸收,物质分子获得能量,分子内的电子跃迁到较高能级而变成激发态。处于激发态的分子很不稳定,它首先图1荧光产生机理通过内转换将部分能量转移给周围分子,回到最低电子激发态振动能级(称为第一级电子激发态振动1.2常用荧光参数-8能级),处于这一能级的分子平均寿命大约是10s,荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、用样量少、如果这时分子通过发射相应的光量子来释放剩余能方法简便以及能提供较多的物理参数等优点。因而被量而回到基态的各个不同的振动能级,就产生了荧广泛地应用于各个研
5、究领域。它能提供包括激发谱、光。因此,最低第一级电子激发态振动能级是产生发射谱以及荧光强度、量子产率、荧光寿命等许多物理荧光的基础。由于分子发射荧光前已有一部分能量参数,这些参数从各个角度反映分子的构象情况,通过对这些参数的测定,不但可以做一般的定量分析,而且收稿日期:2009-05-25基金项目:“生物化学大实验校级精品课”建设项目及“生命科学创新人可以推断生物大分子在各种环境下的构象变化,从而才实验教学体系建设与改革”教改项目(127016)阐明蛋白质结构与功能的关系。作者简介:尹燕霞(1978—),女,山东省泰安市人,硕士,实验师,主要从1.2.1激发光谱和发射光谱事:生物化学与分
6、子生物学实验教学.荧光光谱包括激发光谱和发射光谱两种。激发光实验技术与管理34谱是荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一倍增管,将光信号放大并转为电信号。荧光光谱仪的波长处的荧光强度的变化情况;发射谱则是在某一固样品池是四面透光的石英杯,且用去荧光石英材料制定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布成,它可以作为紫外分光光度计的样品池。测量液体情况。在发射谱中最大荧光强度对应的荧光波长称为时,光源与检测器成直角安排。紫外分光光度计的样最大荧光波长,记为λmax,它是荧光光谱的一个重要参品池是两面透光的样池,它不能作为荧光光谱仪的样数,对环境的极性和荧光团的运动很敏感。为了有利品池
7、。发射光单色器或称第二单色器放在样品池和检于测定,一般都选择激发光谱的峰位测定发射光谱,选测器之间,其作用是让被测样品所发生的荧光透过,而[1]择发射光谱的峰位测定激发光谱。激发光谱与发射滤去由激发光所发生的反射光、闪射光,也就是用来选光谱呈镜象对称关系。择一定波长的光进入检测器测量。计算机辅助记录系1.2.2荧光强度统用以完成绘图及荧光强度的测量。荧光强度是最常用的参数,与很多因素有关,可用下列公式表示:-εbcF=KφΙ0(1-
