MISEQ数据处理步骤

《MISEQ数据处理步骤》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在应用文档-天天文库。

1、一、数据读出（通过“fasta”文件生成“classification”和“txt”文件）1、下载Java：for64位。2、cmd进入DOS界面，进入数据所在的文件夹，逐个分析并命名数据，见下行。Java-Xmx4g-jar..rdp_classifier_2.6distclassifier.jarclassify-c0.8-ffilterbyconf-hhier_output.txt–osamplename.classification.txtinput.fasta注意：刚开始时输入“cd

2、..”（cd空格加两点）即退回上一级目录，直到回到C盘，fasta原始数据也必须放在C盘。手打指令，适用本机。3、用Excel打开目标文件txt文本，“筛选”，选择不同的分类单位进行数据整理和分析。Class:纲Domain:域Family:科Genus:属Order:目Phylum:门Kingdom:界Species:种二、删除chloroplast（叶绿体）1、将原始文件（“fasta”和“classification”文件）拷贝至与程序“mothur”相同的目录下；2、找到后缀名为“H1.cl

3、assification”的数据原文件（以样品H1为例），用Excel打开；3、选中“Class”对应的物种列，“筛选”，在下拉框中勾掉物种“chloroplast（叶绿体，非细菌）”，“确定”；复制第一列到粘贴板；4、新建“H1.accnos”的txt文件，将第一列（物种序列）粘贴，保存、退出；将后缀名改为“.accnos”（窗口界面“组织”、文件夹和搜索选项、查看、勾掉“隐藏已知文件类型的扩展名”）；5、打开程序“mothur”，输入：get.seqs(accnos=H1.accnos,fast

4、a=H1.fasta)，回车，即从原始的物种序列中选出了去除chloroplast以外的新序列，系统会自动生成一个新的fasta文件“H1.pick.fasta”。三、多个样本时的序列深度归一化处理1、经过步骤一、二处理后，以各样本的“*.pick.fasta”为基准，重复步骤一，生成新的“classification”和“txt”文件；2、用Excel打开“txt”文件，记录各个样本的“Totalreads”；以最小的“Totalreads”为基准，进行多个样本的序列深度归一化处理；3、打开程序“

5、mothur”，输入：sub.sample(fasta=H1.pick.fasta,size=*,persample=false)式中，*即为最小的“Totalreads”数。系统会自动生成一个新的fasta文件“H1.subsample.pick.fasta”。4、以新的fasta文件为基准，重复步骤一，生成新的“classification”和“txt”文件，对“txt”文件进行整理，进行后续分析。四、热图1、数据预处理：将原始相对丰度数据取自然对数（lg），对于丰度为0的物种，人为输入经自然对

6、数处理后的下限值；2、保存数据为CSV文件，拷贝至R文件夹“h:/Software/R/”；（注意数据呈现方式，是否需要转置）注意：物种和实验组名称不得出现“—”和空格，以下划线“_”代替。2、按教程操作（蓝白配图命令）。pheatmap(as.matrix(hm[1:m,]),col=colorRampPalette(c("white","blue"))(n=100),cex.main=1,scale="row",key=TRUE,symkey=FALSE,density.info="none",

7、trace="none")如果想颜色与取了自然对数（lg）后的数据相匹配，则将上面的命令中scale="none"，即可。