(医学)数据应用深度解析

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1、基于二代测序技术的RNA-seq数据应用深度解析张学铭科技服务事业部技术总监xuemingzhang@genome.cnIRNA-seq产品介绍IIRNA-seq流程和关键点解析目录IIIRNA-seq生物信息分析内容解析IVRNA-seq数据深度挖掘IVRNA-seq应用案例解析引入---基因表达调控中关注的信息MethylationNovelgenesNon-codingRNAs’targetsSNP/InDelGenesFunctionAnnotation/EnrichmentAlternativeSplicingDiff-Ge

2、nes(c/nc)RNA的主要类型分类名称生物学作用CodingRNAMessengerRNA，mRNA编码蛋白质LongnoncodingRNA，lncRNAmicroRNA，miRNA调控功能RNA•染色质结构Smallinterference•DNA甲基化FamilyRNA，siRNA（植物）NoncodingRNASmallRNA•基因转录Piwi-protein•mRNA翻译interactingRNA，•RNA降解piRNA（动物）RibosomalRNA，rRNA形成核糖体各类RNA被研究的程度：mRNA>smallRN

3、A>LncRNANGS在转录组学研究中的应用测序技术研究目的基因结构分析转录组测序融合基因、可变剪切分析、SNP分析等基因差异表达分析数字表达谱测序GO和KEGG富集分析蛋白互作网络分析已知和NovelmiRNA差SmallRNA测序异表达及其作用的靶基因分析已知和NovelLncRNALncRNA测序差异表达及其作用的靶基因分析RNA-seq与其他转录调控研究的比较技术cDNAlibrary-seqMicroarrayRNA-Seq原理一代测序核酸杂交高通量测序分辨率单碱基几十到一百碱基单碱基通量低高高是否依赖基因组信息否是否背景噪音

4、低高低成本/基因非常高低低应用同时分析所有表达基因否是是基因表达检测范围无±100倍±10,000倍基因结构研究是否是1.高通量、单碱基、灵敏可靠、成本低；RNA-seq优势2.可同时获得RNA的序列与丰度信息。RNA-seq流程和关键点实验设计及样本选择TotalRNA的提取与质检文库的构建及库检文库的构建及库检数据量确定及上机测序一、取样策略不同发育阶段时间序列不同器官、不同时间点材料对照与处理（药物等）环境条件选择宿主与病原正常组织VS病变组织正常与病变正常或良性细胞VS癌细胞取样策略（关键点）降低个体大小、避免系统误

5、差，健康状况、遗减少误差来源传背景等因素造成的误差随机性普遍性遗传背一致性景相同遗传背景最好样品培养、生长相同或相似，环境、取样及提以避免遗传背取方法和建库方景差异对差异法等一致表达的影响二、实验重复的设置当生物学重复从2个变成3个或3个以上时，差异表达分析结果更准确。差异基因检出率差异转录本检出率生物学重复的个数生物学重复的个数三样本的质检TotalRNA样品检测（3类方法评估）微量分光光度计检测RNA样品是否有糖、蛋白及DNA等杂质污染；琼脂糖电泳分析样品的降解程度以及是否有蛋白污染等；Agilent2100检测样品的28s/

6、18s值和RNAintegritynumber(RIN)值凯奥K5500微量分光光度计Agilent2100四、文库类型•适用真核生物转录组和表达谱普通转录组文库•应用广泛，技术成熟•适用真核生物转录组和表达谱链特异性文库•区分方向信息，信息分析优势•适用表达低丰度基因检测DSN均一化文库•适用于lncRNA、全转录本建库•适用转录组、表达谱、lncRNA全转录本文库•保留除rRNA外全部RNA信息Ribo-Zero™GoldKits(Human/Mouse/Rat)去除rRNA的试剂盒推荐五、确定测序数据量测序数据量取决于研究物种基因

7、数目、长度和研究目的。物种类型基因个数基因表达定量基因结构分析高等动物3000010M-20Mcleanreads6Gb-10Gbcleandata高等植物20000-2500010M-20Mcleanreads6Gb-10Gbcleandata真菌5000-130006M-10Mcleanreads2Gb-4Gbcleandata细菌1500-40002M-4Mcleanreads1Gb-2Gbcleandata六、信息分析比较策略•不同时间节点以零时间点作为control，其余时间节点样本分别与control进行差异分析。不同时

8、间节点样本与相邻节点样本进行比较。不同时间节点样本进行两两比较。•不同实验处理（controlVScase）Control与case间比对Case与case间比对•不同品系或处理等+不同时间节点同一