应用RT—PCR技术快速检测马铃薯纺锤块茎类病毒

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1、第31卷第2期延边大学农学学报Vo1．31NO．22009年6月JournalofAgriculturalScienceYanbianUniversityJun．2009应用RT—PCR技术快速检测马铃薯纺锤块茎类病毒康哲秀，金顺福，姜成模，玄春吉，刘宪虎(1．延边农业科学研究院；2．延边大学农学院：吉林龙井133400)摘要：根据马铃薯纺锤块茎类病毒序列，设计合成了一对特异性引物．以感染PSTVd的马铃薯试管苗为材料，提取其总RNA，获得纯度较高、完整性较好的总RNA．以此总RNA为模板，进行cDNA合成及PCR扩增，从感病组织中扩增得到一段约为359bp

2、的特异RNA扩增产物，与理论设计大小一致，而健康组织无此扩增产物．关键词：马铃薯；纺锤块茎类病毒；RT—PCR；总RNA中图分类号：$532文献标识码：A文章编号：1004—7999(2009)02—0i01—04马铃薯纺锤块茎类病毒(PotatoSpimdleTuberViroid，简称PSTVd)是引起马铃薯纺锤块茎病的原因，据报道，PSTVd强系可使马铃薯减产达60，弱系减产约20～359／5，常造成较大的经济损失[．该病毒是马铃薯种薯检疫规程中的主要检疫对象，具有广泛的传播途径，是唯一不能通过茎尖剥离、组织培养脱毒，而必须通过严格的检测汰除的病毒．近

3、年来，PSTVd在我国北方马铃薯主要产区普遍发生，危害日趋严重．控制其传染的有效方法仅依赖于PSTVd的早期鉴定[．目前采用的方法有指示植物法、聚丙烯酰胺凝胶技术、核酸斑点杂交技术．随着PCR技术的发展，RT—PCR技术已越来越广泛地应用在RNA病原鉴定上，具有快速、灵敏、简便、特异性强等优点，可检测出植物组织中含量极低的病毒RNA．1材料与方法1．1材料感染PSTVd的马铃薯品种“哈一23”试管苗由俄罗斯哈巴农业科学研究院马铃薯研究所提供，健康马铃薯品种“哈一23”试管苗及待测的6个国外马铃薯品种资源试管苗由延边农业科学研究院提供．1．2方法1．2．1总R

4、NA提取称取i00mg样品放入1．5mL离心管中，然后加入1mL提取缓冲液(100mmol／LTris，用盐酸将pH值调至7．6；100mmol／LEDTA—Na；1的SDS)研磨成匀浆组织，在100。C水浴5min，取出后一2O℃冷却，然后13000r／min离心10min，取上清液700L加入1．5mL离心管中，再加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(25：24：1)，震荡摇匀(成乳白色)，13000r／min离心10min，取600L上清液加入等体积氯仿：异戊醇(24：1)，震荡摇匀，l3000r／min离心10min，取300L上清液放人干净的离心管中，再

5、加入30L3M醋收稿日期：2009⋯0305作者简介：康哲秀(1980一)，男(朝鲜族)，吉林通化人，延边大学农业科学研究院研究实习员，在读硕士．刘宪虎为通讯作者，Tel：0433—326l775。E—mail：liuxh@ybu．edu．cn1O2延边大学农学学报第31卷酸钠和520L异戊醇震荡混合，13000r／rain离心10min，倒净离心管中液体，留沉淀，加入700“L75％的酒精，l3000r／rain离心10min，倒净离心管中液体，留沉淀，室温干燥、挥发，加人700L丙酮，用力摇匀，13000r／min离心10min，倒净离心管中液体，留沉淀

6、，室温干燥、挥发(无异味即可，约10rain)，加入50L用DEPC处理过的无菌水，65℃水浴5min，取出轻弹离心管底部，使沉淀溶解，一20℃保存备用．1．2．2PSTVd特异引物设计根据PSTVd序列特点，设计合成l对引物(Pc：5GGATCCCTGAAGCGCTCCTC—CGAGCCG3，Ph：5CCCGGGAAACCTGGAGCGAACTGG3)，由北京华美生物工程公司合成．预计片段长度为359bp．1．2．3cDNA合成以总RNA为模板，在引物Pc的引导下，合成PSTVd的cDNA第1链．反应体系：总RNA1．5L，引物Pc(10p-tool／L)

7、0．5．uL，dNTPs(10p-tool／L)0．5L，ReverTraAce0．5p-L，5×RTbuffer2．0p-L，灭菌蒸馏水15L．应用程序：40℃，40min；95℃，10rain．1．2．4PCR扩增PCR扩增在20L反应体系中进行．反应体系含5LcDNA，1．0L引物Pc(10p-mol／L)，1．0p-L引物Ph(10p-mol／L)，10p-LTaqDNA聚合酶(5U／P-L)，3L灭菌重蒸水．扩增反应条件为：93℃、90S，93℃、20S，64。C、20S，67℃、20S．循环45次，保持1O。C．取5L扩增产物在2的琼脂糖凝胶上电

8、泳(终浓度0．5p-g／mL溴化乙锭染色)，电泳缓冲