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时间:2019-08-04
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1、质粒DNA的提取与电泳检测一.实验目的1.通过质粒DNA的提取和检测,掌握提取质粒的方法以及用凝胶电泳分离鉴定质粒DNA的方法。二.实验原理1.质粒概述:质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位,现在习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA分子。在基因工程中质粒常被用做基因的载体。目前,已发现有质粒的细菌有几百种,已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小,约为细菌染色体的0.5%-3%,大小在1Kb-200Kb之间。在基因工程中,常用人工构建的质粒作为载
2、体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体,如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。2。质粒DNA的提取:已经提出过许多方法用于从细菌中提纯质粒DNA,这些方法都含有以下3个步骤:◆细菌培养物的生长。◆细菌的收获和裂解◆质粒DNA的纯化。三.仪器和试剂试剂:1、质粒快速提取试剂盒溶液1(SET缓冲液)、溶液2(LysisBuffer)、溶液3(3MNaAc,Ph4.8)、结合缓冲液、漂洗液、洗脱缓冲液、吸附柱、废液收集管2、电泳检测TAE缓冲液、琼脂糖、Loadingbuffer、EB仪器、耗材:台式高速离心机、电泳仪、电泳槽、
3、移液器、1.5mlEppendorf管四.操作步骤(1)培养细菌:大肠杆菌接种到LB培养基2ml-5ml中,37度振荡培养8-16小时.(2)收集菌体:取培养液1.5ml于Eppendorf管中,12000rpm离心3分钟,去掉上清液.(3)裂解:加入100ul溶液1(用完后4度保存),充分吹打混匀后,加入150ul溶液2(用完立即拧紧瓶盖),温和颠倒5-10次,零下20度放置3分钟.加入150ul溶液3,温和颠倒5-10次,放置5分钟.12000rpm离心5分钟(4)收集质粒:取吸附柱,加入420ul结合缓冲液,取离心后的上清液
4、到吸附柱中(不要吸到蛋白沉淀),混匀.12000rpm离心30秒,弃去废液.吸附柱装回收集管。(5)向吸附柱加入700ul漂洗液,12000rpm离心30秒。倒掉废液,装回吸附柱。(6)重复(5),再次12000rpm离心2分钟以完全去除漂洗液。(7)回收质粒:将吸附柱移到一个新的1.5mleppendorf管中,向吸附膜中央加入50ul洗脱缓冲液(水浴预热至70度),溶解提取物,室温放置2分钟,12000rpm离心2分钟.(8)琼脂糖凝胶电泳检测提取结果.五、试验结果六、结果分析问题思考?1.说明碱裂法提取质粒的原理?2.电泳结
5、果出现几个条带?各是什么?
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