蛋白质的性质及分离和纯化

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1、第3章蛋白质的通性、纯化和表征蛋白质的性质蛋白质的分离纯化蛋白质的性质蛋白质的两性解离（酸碱性质）蛋白质的胶体性质蛋白质的变性和复性蛋白质的紫外吸收蛋白质的呈色反应蛋白质的沉淀蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，如谷氨酸、天冬氨酸残基中的和-羧基、赖氨酸残基中的-氨基、精氨酸残基的胍基和组氨酸残基的咪唑基，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为0，此时溶液的pH称为蛋白质的等电

2、点。蛋白质溶液的pH大于等电点时，该蛋白质颗粒带负电荷，反之则相反。蛋白质的两性解离体内大多数蛋白质的等电点接近pH5.0，在体液pH7.4环境下可解离成阴离子。少数蛋白质为碱性蛋白质，如鱼精蛋白、组蛋白等，也有少量蛋白质为酸性蛋白质，如胃蛋白和丝蛋白等。蛋白质的电泳和离子交换层析技术就是依据蛋白质的两性解离性质。蛋白质在pH值低于或高于其pI时带有电荷，在电场的作用下移动，称为电泳。由于各种分子所带电荷的多少及分子量大小不同，因而它们在电场中移动速度也不同，可用于检测、分离蛋白质。根据支持物的不同，电泳可分为薄

3、膜电泳、凝胶电泳等，如凝胶电泳的支持物为琼脂糖、淀粉或聚丙烯酰胺凝胶.酸性蛋白质的等电点为酸性，碱性蛋白质的等电点为碱性。等电点时蛋白质的特性：溶解度最小，应用于蛋白质的分离、提纯粘度最小渗透压最小膨胀性最小导电性最小蛋白质的胶体性质蛋白质是高分子化合物，分子直径大小为1-100nm,属于胶粒的范围。维持蛋白质胶体溶液稳定的重要因素有两个，一是蛋白质胶体颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，形成颗粒表面水化膜；另一是蛋白质胶粒表面带有同种电荷。二者可起胶粒稳定的作用，从而阻断蛋白颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的

4、沉淀析出。如除去蛋白胶粒上述两个稳定因素时，可使蛋白质从溶液中析出。在蛋白质分离中的盐吸和丙酮沉淀就是依据这一原理。另外,蛋白是生物大分子，依据不同蛋白质分子大小差异,在通过有分子筛作用的凝胶时受到排除力不同，可利用透析、凝胶过滤、分子筛层析、超离心等技术分离蛋白质。由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。胶体溶液的性质，如丁达尔现象、布郎运动、电泳现象、不能通过半透膜等。蛋白质胶体稳定的因素：具有水化层，非等电点时带电荷；应用：利用透析法或超过滤法可纯化蛋白质：将非蛋白质的小分子物质除去，破坏蛋白质胶

5、体的稳定的因素，可以将蛋白质分离蛋白质的变性和复性蛋白质在某些理化因素的作用下空间构象受到破坏,从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性(denaturation)。变性的实质是蛋白质的天然构象受到破坏,涉及二、三、四级结构的改变,二硫键及各种次级键破坏，但一级结构不变，无肽键断裂.变性后由于肽键松散，面向内部的疏水基团暴露于分子表面，蛋白质分子溶解度降低并互相聚集而易于沉淀，其活性随之丧失。另外表现为粘度增加,结晶能力消失，易被蛋白酶水解.造成蛋白质变性的因素有多种，常见的有高温、高压、紫外线和乙

6、醇等有机溶剂、重金属离子及生物碱等。在医学上，上述变性因素可导致病源微生物蛋白的变性失活，常被用来消毒灭菌。相反，在蛋白质分离纯化过程中或有效保存蛋白质时，应防止蛋白质变性。当蛋白质变性程度较轻，可在消除变性因素条件下使蛋白质恢复或部分恢复其原有的构象和功能,称为复性(renaturation)。但许多蛋白质或结构复杂或变性后空间构象严重破坏，不可能发生复性，称为不可逆变性。蛋白质的紫外吸收大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸在280nm附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm

7、附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。蛋白质的呈色反应蛋白质分子中肽键可与某些试剂发生显色反应，且产生的有色物质与蛋白质浓度相关，氨基酸则不出现此反应。此特性可用于蛋白质定性、定量检测，如双缩脲反应。蛋白质的颜色反应：双缩脲反应：双缩脲在碱性溶液中与硫酸铜反应产生红紫色络合物，此反应称为双缩脲反应。蛋白质分子大小与形状蛋白质分子的大小：1×104－1×106D蛋白质分子的形状：球形，纤维状、椭圆形蛋白质分子量的测定①根据化学组成测分子量②凝胶过滤层析（分子筛层析）③SDS－PAGE法

8、④超离心法⑤渗透压法①根据化学组成测分子量对含微量元素的蛋白质，先测定微量元素的含量，然后确定最小分子量，如肌红蛋白含铁为0.335％，其最低相对分子量为;最低相对分子量=铁的原子量×100/铁的百分含量＝55.8×100/0.335=16700测定蛋白质中氨基酸含量少的氨基酸②凝胶过滤（分子筛层析法）原理：蛋白质分子通过层析柱的速度并不直接取决于分子质量，而是它的斯托克