第九章 免疫学实验技术概述

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1、第九章免疫学实验技术概述血清学反应：体外发生的抗原抗体反应。第一节体液免疫的检测——血清学反应所有血清学反应类型的基本原理：抗原抗体反应的特异性。二、血清学反应的一般规律(一)特异性Ab只能与相应Ag特异结合。Ag表面常具有多个(多种)不同表位，所以免疫血清中也应含有相应多种特异性Ab。抗原与抗体的结合的特异性（二）交叉性交叉抗原：不同的Ag物质之间存在相同的Ag表位时，称为交叉抗原。交叉反应：又不同抗原制备的抗血清除与各自的相应Ag发生反应外，尚能与对方Ag发生反应。通常两种Ag之间亲缘关系越近，交叉

2、反应程度越高。AB抗原与抗体的结合的交叉性(三)用已知测未知所有血清学反应都毫无例外地是用已知Ag测未知Ab或用已知Ab测未知Ag。用已知测未知的依据：抗原抗体的反应是特异的。正确理解实验原理或进行试验设计的关键是搞清楚什么是已知，什么是未知，谁是抗原身份，谁是抗体身份，谁是身兼两职的。(四)试验与抑制试验许多血清学试验可以被相应的Ag／Ab所抑制，即抑制反应现象的出现，抑制试验可以验证反应的特异性；还可使一些不易被检测的Ag(如简单半Ag)或Ab(如单价Ab)，得以检出。(五)结合力与离解力Ag，Ab

3、的结合为弱能量的非共价健结合，其结合力决定于Ag表位与Ab的结合点之间所形成的非共价健的数量，性质和距离，包括4种力的作用：Ag-Ab结合的离解力指Ag-Ab结合具有可逆性，因为Ag-Ab之间靠非共价结合，因此在一定条件下可使其解离。解离后的Ag-Ab仍保留其原有活性。(六)结合比例Ag与Ab的结合常需适当比例才出现可见反应，在最适比例时反应最明显；这种现象可以用“格子学说”来解释：Ab(1gG)为二价，Ag通常为多价，只有Ag，Ab结合形成大的复合物，肉眼才可见；带现象只有当Ag与Ab比例适当时，才能

4、形成大的复合物，比例不适当，就只能形成小的复合物而抑制反应现象的出现.前带现象：Ab过剩，Ag过少；稀释Ab后带现象：Ag过剩，Ab过少；稀释Ag。(七)血清学反应的影响因素1．电介质：生理盐水，缓冲盐水，少数动物(禽)血清用8.5％NaCl；2．温度；3．pH：pH6.0～8.0三、血清学技术的优越性(一)检样量少，预处理简单：一滴血清/血、一根羽毛、少许组织悬液、植物一片子叶等。(二)种类多，可择优选用(三)方法简便快速(四)特异性、敏感性(五)Ag/Ab定位、定量四、血清学试验的制定原则特定的或建

5、立新的血清学方法时，应注意以下原则：(一)Ag准备和提纯1．购自试剂公司：如半Ag、激素、酶、农药、抗生素、昂贵的天然Ag等。2．自制：一般天然Ag、动物血清、组织Ag等(二)Ab制备提纯(三)操作程序制定(四)材料准备和滴定：工作浓度滴量(五)试验条件选择：(六)特异性试验1．Ag、Ab验证：反复、重复验证2．交叉试验3．抑制试验(阻断)(七)敏感性试验(八)重复性试验(九)稳定性试验五、血清学试验的应用(一)血清学诊断(二)生物活性物质超微定量(三)Ag/Ab亚细胞、细胞水平定位(四)Ag组分分析，

6、如病毒结构蛋白可用免疫转印，免疫沉淀(琼扩、电泳、交叉免疫电泳等)(五)物种鉴定分型(六)有机物提取纯化六、血清学试验的类型（一）沉淀反应：环状沉淀试验琼脂扩散：免疫电泳对流电泳火箭电泳双向电泳补体结合试验（二）凝集反应：直接凝集：平板、试管间接凝集：间接血凝、炭凝、乳胶凝集协同凝集：凝集抑制：（血凝抑制）（三）与补体有关的实验：活性、组分、补结、免疫粘附血凝等。（四）中和试验（五）标记技术：同位素标记荧光标记：化学发光免疫技术酶标记：组化法、测定法（ELISA）ELISA：间接法、免疫酶斑点技术（do

7、t-ELISA）、竞争法、夹心法、桥联法（六）免疫电镜组化技术胶体金铁蛋白标记技术BB0竞争酶联免疫吸附检测法(CiELISA)原理0ng/ml，检测线为清晰红色条带；1ng/ml，检测线与0标准品的相似;3ng/ml，检测线浅于0ng/ml标准品;10ng/ml，检测线明显浅于0;肉眼判定检测限可达3ng/ml。免疫层析法检测CAP结果第二节细胞免疫技术自学