western blot 操作流程

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1、Westernblotprotocol第一部分：样品制备（一）、所需试剂：1.Western及IP细胞裂解液(KGP701)：Western及IP细胞裂解液分装后存于-20℃冰箱中，避免反复冻融；2.PMSF（100mM）：sigma；3.PBS（二）、所需耗材：离心管、细胞刮、各种规格的枪头（三）、所需仪器：各种量程的移液器、4℃高速离心机（四）、操作步骤：1．在每mL冷Western及IP细胞裂解液加入10μL100mMPMSF，混匀。冰上保存数分钟待用；2.倒掉已处理好的细胞的培养液，预冷的PBS冲洗两次，每次振摇数次以尽量去

2、除培养液，将培养瓶置于冰上；73.加入上述适量配制好的Western及IP细胞裂解液（10个细胞加入Western及IP细胞裂解液1mL～2mL），用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触；4.裂解完毕后，迅速用细胞刮将细胞刮于培养瓶一侧（动作须块），然后用枪将细胞碎片和裂解液转移至1.5mlEP管中（操作在冰上进行），10000转/分，4℃离心5min（离心机需要预冷）；5.取上清转移至新的预冷的离心管中，蛋白定量（BCA法）；第二部分：测定蛋白浓度（一）、所需试剂：凯基BCA蛋白含量检测试剂盒（KGPBCA），分装后存于-20℃冰箱

3、中，避免反复冻融。（二）、所需耗材：Ep管、96孔板、离心管、细胞刮、各种规格的枪头1（三）、所需仪器：各种量程的移液器、振荡器、37℃烤箱、酶标仪（四）、操作步骤：1.根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀；2.取一块96孔板，按照下表加入试剂：孔号01234567样品1蛋白标准溶液（μL）01248121620去离子水（μL）201918161284019样品1对应蛋白含量（μg）00.51.02.04.06.08.010.0BCA工作液（μL）200200200200

4、2002002002002003.把96孔板放在振荡器上振荡30sec，37℃放置30min，然后在562nm下比色测定。以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线；4.稀释待测样品至合适浓度，使样品稀释液总体积为20μL，以标准曲线0号管做参比，在562nm波长下比色，记录吸光值；5.根据标准曲线计算样品实际浓度（单位：μg/μl），将所有样品浓度用裂解液调至4μg/μl；6.分装保存于-80℃,避免反复冻融。第三部分：Westernbloting（一）、所需试剂：1.30%丙烯酰胺溶液：丙烯酰胺29.2g，甲叉双丙

5、烯酰胺0.8g，加水至100ml，棕色瓶4℃保存。2.1.5mol/LTris-HCl分离胶缓冲液pH8.8(4x)：取18.15gTris，用1NHCl调pH至8.8，加水至100ml，4℃保存。3.1mol/LTris-HCl分离胶缓冲液pH6.8(4x)：取12.114gTris，用1NHCl调pH至6.8，加水至100ml，4℃保存。4.电泳缓冲液(pH8.3)：取14.49g甘氨酸，3.02gTris，1gSDSor100ml10%SDS，加水至1升，4℃保存。25.转印缓冲液：取14.49g甘氨酸，3.02gTris，2

6、00ml甲醇（最后加），加水至1升，常温保存。6.1xTBST：取8.766g氯化钠，6.058gTris，用HCl调PH值至7.6，最后加0.5mlTween20，加水至1升，常温保存。7.10%APS:过硫酸铵0.1g，加ddH2O1ml，-20℃保存。8.5%封闭液：脱脂奶粉2g，加TBST40ml，现用现配。9.5xSDS上样缓冲液、甲醛、脱脂奶粉、一抗、二抗、PVDF膜、ECL发光液等。（二）、所需耗材：Ep管、各种规格的枪头、镊子、塑料板、离心管等。（三）、所需仪器：各种量程的移液器、电磁炉、水平摇床、封口机、冰箱、制冰

7、机、电泳设备一套、电转设备一套。（四）、操作步骤：1、SDS-PAGE电泳1.1.预先清洗电泳玻璃板，晾干；1.2.玻璃板对齐后放入夹中卡紧，准备灌胶（对齐夹紧，以免漏胶）；1.3.根据蛋白大小制备分离胶（PH8.8）：灌分离胶时，可用1ml枪加入胶（直接倒也可），预留1.5cm高度配制浓缩胶（距梳子下缘1厘米）。加入去离子水压线，液封，室温放置0.5-1hr左右至聚合完全（具体见附表）；1.4.胶凝固（当去离子水和胶之间有一条折线时）后，倒去胶上层的去离子水，并用吸水纸吸干；1.5.制备4%浓缩胶（PH6.8）：制备浓缩胶，将剩余

8、空间灌满浓缩胶之后，插入梳子，凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻拔出。凝胶时间约0.5-1hr（具体见附表）；1.6.放入电泳槽（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。若只跑一块胶，槽的另一面要垫一块塑料板且有字的一面向外），用电泳