中性粒细胞相关实验方法

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1、常用中性粒细胞分离方法（外周血、骨髓提取均可）（一）Percoll非连续密度梯度离心法（张灿老师课题组使用方法）优点：Percoll的主要成分是硅石胶，对中性粒细胞的化成成分和活性无影响。回收率高，存活率高。缺点：可能会有部分红细胞分离不干净，影响不大。（二）Ficoll-Hypaque密度梯度离心法优点：回收率高和percoll差不多。缺点：由于Ficoll结构中的长链烃组成具有LPS样作用，因此在分离过程中，会对中性粒细胞有激活作用。（三）Dextran作用下红细胞自然沉降法优点：能够完全分离红细胞缺点：回收率最低（四）裂解红细胞法优点：能够完全分离红细胞

2、缺点：回收率低纯度、回收率和存活率检测方法纯度：瑞吉染色存活：台盼蓝计数回收：分离后（计数）/分离前（血常规检测）Percoll非连续密度梯度离心法（张灿老师实验室的方法）和培养备注：使用外周血或骨髓提取都是可以的，一般来说，外周血每1ml能够提取1*10^6cell，数量比较少，如果骨髓提取，一只小鼠约能提取1*10^7cell。外周血和骨髓提取除了来源不一样，分离方式是相同的。1.试剂耗材：percoll原液（pharmacia　orsigma）10*PBSRPIM1640培养基2.溶液配制（1）用percoll原液和10*PBS按照9:1的比例（v/v）

3、配成混合液，定义为100%percoll。（1）用1*PBS和100%percoll配置55%和65%的percoll。（溶液配制均在无菌环境下操作）3.分离步骤（1）小鼠酒精浸泡消毒。（2）小鼠颈椎脱臼处死，立即切下其后肢的胫骨和股骨，并分离除去所有组织、皮肤。将胫骨和股骨浸泡在不含有血清的RPIM1640培养基中。（3）剪短胫骨股骨两端，用1ml注射器想胫骨股骨中吹灌不含有血清的RPIM1640培养基重悬得到骨髓细胞重悬液，一直吹到骨片泛白为止。（4）将含有骨细胞的RPIM1640培养基4000rpm离心3分钟。（5）用RPIM1640培养基重悬得到骨髓细

4、胞。（2ml）（6）取一个新离心管，加入2ml65%percoll分离液，再加入2ml55%percoll分离液，最后加入2ml骨髓细胞液。（缓慢不要破坏溶液界面）（7）2500rpm离心30分钟。吸取55%和65%交界面，加入1*PBS，1000rpm离心3分钟，弃上清，重复3次。（8）用RPIM1640培养基重悬得到小鼠骨髓中性粒细胞悬浮液。注意：（1）中性粒细胞为终末细胞，不可传代寿命短。（2）张老师组一般细胞和药物共同富裕1小时。（3）3-4小时以内，细胞状态都比较好。PS：也可以用45%55%80%三层分离，500g离心30分钟，弃上清和55%以上部

5、分，下午55-80%交界面。加入1倍体积的1*PBS，200g离心3分钟，。。。后同。人血浆提取问题1.新鲜血液，中性粒细胞寿命较短。2.采学后，用EDTA抗凝处理。3.具体需血量根据需求来定：每1ml血=1*10^6cell。文献说如果做wb，大约要30ml血液。后续的一些实验方法1.中性粒细胞tranwell药物趋化实验（1）分离中心粒细胞，测定细胞数（2）transwell小室下室加600ul的趋化因子+无血清培养液（3）上室加入100ul细胞+无血清培养液（4）孵育2小时（5）拿出小室，将上室取出放新的孔内，先将膜上细胞擦去后，再予以离心，将膜下粘附细

6、胞离心至下室，然后予以CCK8间接测定细胞。（6）会有细胞掉到下室，有文献是分开固定计数的。2.中性粒细胞株只有中性粒前体细胞的细胞株，然后诱导分化得到中性粒细胞。HL60.NB4均可。3.流式检测凋亡检测和材料接触后凋亡情况用Annexinv和PI双染，分离后直接标记，标记后应立即检测4.瑞氏染色有染色试剂盒，按照说明书操作即可。5.尾静脉回输观察