疫组化基本技术1

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1、《免疫组化基本技术》主要内容一、实验的设计二、石蜡切片的脱蜡至水三、内源性酶的消除方法四、IHC的非特异性染色五、抗原的暴露和修复六、抗体的购置及注意事项七、抗体最佳稀释度的测定和保存八、显示系统及衬染剂的选择和配制九、IHC常用缓冲液一、实验的设计1.查阅相关文献，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。2.列出IHC实验操作流程，选择何种IHC前处理方式。3.通过预实验寻找第一抗体的最佳稀释度，应设置何种对照。4.每批实验应用同一稀释度的一抗，孵育时间和温度，同一的显

2、色时间。5.列出阳性判定的标准6.预期达到的目标组织与细胞材料的制备1.手术切除标本的取材：抗原在组织中的分布常不均一，取材时应考虑：主要病灶，病灶与正常组织交界处，远离病灶的正常组织。组织大小：长1cm×宽1cm×厚0.2～0.3cm。2.各种小组织的活检取材：它不仅体积小，取材困难，不易取到主要病灶，因此对标本的处理应特别慎重，及时固定，包埋时要平整。一、组织取材注意事项1.组织要求离体后30min内浸入固定液，尤其是开展分子生物学工作。2.注意防止人为因素的影响刀和剪要快，刀要足够长。3.组织块的大小厚为0.1～0.3c

3、m，大小可根据需要而定4.动物和人体组织的取材位置要视研究目的，观察部位而定5.取材时间原则上，应尽快取材，但比较大的手术标本如胃、肺、肠等器官，最好先固定后取材。6.注意包埋方向7.边缘标记8.保持材料的清洁9.切除不需要的部分10.明确编号，登记11.骨组织还需脱钙二、组织标本的固定1.目的(1)防止组织细胞的死后变化，防止自溶和腐败，以保持组织细胞的固有形态。(2)使细胞内的蛋白质、脂肪、糖和酶等各种抗原成份转变成不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时相仿。（3）使组织中的各种物质沉淀和凝固起来而产生不同的折射率，造成

4、光学上的差异，以便染色后易于鉴别和观察。（4）固定剂兼有硬化作用、使组织硬化、增加组织硬度、便于制片。（5）防止细胞过度收缩或膨胀而失去其原有形态结构。（6）经过固定的组织能对染料产生不同的亲和力而着色清晰，便于辨认。2.固定方法的选择及注意事项(1)大小2cm×2cm×0.3cm(2)及时固定(3)固定时间固定时间要视组织块的厚薄，固定液的种类及浓度，温度而定，原则上，组织块大小与固定时间成正比，固定液的穿透力及浓度与固定时间成反比。(4)组织固定后必须彻底冲洗。三、组织脱水、浸蜡及包埋1.目的组织经固定和

5、水洗后含大量水分,需用乙醇类试剂进行脱水,水脱完后,组织内含有大量的乙醇,还必须用能溶解乙醇的二甲苯来置换,最后经浸蜡,组织细胞内被大量石蜡支称,才使组织能用于石蜡切片。2.脱水剂的种类：非石蜡溶剂的脱水剂和脱水兼石蜡溶剂的脱水剂。常用的脱水剂:(1)乙醇；(2)丙酮；(3)正丁醇；(4)淑丁醇；(5)环乙酮；(6)松脂醇；(7)二氧陆环。3.常用的透明剂：(1)二甲苯；(2)甲苯；(3)苯；(4)香柏油；(5)苯甲酸甲酯；(6)氯仿；(7)冬青油;(8)苯胺油4.原则脱水方法甚多，一般需逐级进行脱水，否则可引起组织强烈收缩

6、，组织变形。在脱水完全的前提下，组织的透明必须彻底，但不能过长，否则会引起组织切片困难。5.常规石蜡包埋过程(1)脱水：75％、85％乙醇，95％Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ乙醇，无水乙醇Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。(2)透明：二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯Ⅲ(3)浸蜡：石蜡Ⅰ、石蜡Ⅱ、石蜡Ⅲ(4)石蜡包埋：修蜡块，标号四、组织切片切片可分石蜡切片、冰冻切片、火棉胶切片，IHC切片要求不同与常规切片，需连续有序，防止脱片等特殊要求。1.切片前的准备工作(1)载玻片的清洁：市售载玻片需经清洁液泡24h，流水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶。(2)切片粘合剂的种类多聚

7、赖氨酸（分子量300KD）：0.5%浓度。APES试剂（3-氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片→丙酮5min→APES（1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入APES试剂1～3次→纯丙酮洗二次→干燥玻片→用铝箔包好，室温或4℃保存备用。铬矾明胶液：铬矾0.5g明胶5gH2O21000ml甲醛明胶液：40％甲醛2.5ml明胶0.5gH2O2100ml2.切片要求及注意事项：(1)连续切片按序贴在玻片的下1/3。(2)52－60℃烤片18h。(3)切片厚2～4μm。(4)切片刀要快(5)编上号(6)切片可在4℃保存数年（石蜡切片

8、）石蜡切片脱蜡至水冰冻切片从-80℃取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。石蜡切片需经如下脱蜡才能做IHC。二甲苯Ⅰ10min，二甲苯Ⅱ10min，二甲苯10minⅢ，无水乙醇2min，95％乙醇2min，85％乙醇2min，75％乙醇2min，流水冲洗。五、内源性