运用DOE方法降低抗体生产过程中五聚甘露糖水平的工艺开发_徐菲菲

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1、药物生物技术PharmaceuticalBiotechnology2017，24(4):305～309305运用DOE方法降低抗体生产过程中五聚甘露糖水平的工艺开发1，22222*2*徐菲菲，王太海，杨玲，沈俊，徐水清，周新华(1.复旦大学生命科学学院，上海200433;2.嘉和生物药业有限公司，上海201203)摘要通过试验设计(DOE)方法和JMP软件分析快速优化重组CHO细胞在生物反应器中的培养工艺，保证抗体高表达量的同时降低五聚甘露糖(Man5)水平。以培养基CD-CIM1为基础培养基，

2、在细胞培养过程中添加补料培养基流加培养，利用3L小型生物反应器，对反应器pH值，溶氧(DO)，温度(T)3个控制参数进行3因子2水平比较，以抗体表达量(Titer)、产物蛋白Man5水平为响应变量，应用JMP软件进行拟合模型最小二乘法分析，找出最优工艺参数。用优化的工艺参数进行验证，并且放大到50L生物反应器中，先后培养两个批次，进一步验证优化结果。通过分析，参数T、pH值及3因素间两两交互作用对Titer均有显著影响，DO对Titer影响不显著;pH对Man5有显著影响，T、DO及3因素间两两

3、交互作用对Man5的影响均不显著。结果预测，为获得高表达量及可接受范围(0%～10%)内的Man5水平，最优工艺参数为pH7.10，DO60%，T34.5℃。用优化工艺在小型生物反应器内进行验证，收获时抗体表达量分别为1152，901mg/L;Man5水平分别为8.60%，7.49%;两个批次的50L生物反应器放大培养，抗体表达量分别为840，849mg/L，Man5水平分别为6.03%，9.45%，结果均符合预期。成功运用DOE方法快速高效的建立了降低Man5水平的细胞培养工艺，为后期放大提供

4、依据。关键词抗体生产;细胞培养;生物反应器;高甘露糖;工艺优化;试验设计中图分类号TQ460.6文献标志码A文章编号1005-8915(2017)04-0305-05doi:10．19526/j．cnki．1005-8915．20170405随着蛋白重组与单克隆抗体技术的发展，抗体药物如平为18.09%。通过试验设计，比较不同条件对细胞生长的ADC(抗体-药物偶联物)、靶向药物等在医药行业越来越被影响，研究pH、DO、T3个反应器控制参数对抗体表达量及重视，抗体的糖基化类型对其功能、体内代谢及免

5、疫原性有Man5水平的影响，结合JMP软件进一步模拟预测，确定最［1-3］着重要影响。文献表明含甘露糖水平高的抗体半衰期缩优条件，再以3L反应器(n=2)来验证其控制参数改变的［4-6］短，在体内很容易被清除，进而影响抗体的治疗效应，因可行性，之后放大至50L反应器生产。此是抗体候选分子能否进入商业化的关键考虑因素之一。1材料与方法本实验的研究对象为表达新型治疗性IgG抗体的CHO细胞，在前期的反应器培养中，存在着五聚甘露糖(Mannose1.1细胞5，Man5)水平偏高(10%～20%)的问题

6、。一般来说可以通基因重组细胞株CHODG44由嘉和生物药业有限公司过以下3种途径调节高甘露糖水平:利用基因工程改变细提供，表达治疗性单克隆抗体，该抗体用于治疗类风湿性关胞株;在培养基中添加关键酶的抑制剂或改变细胞的培养节炎等免疫系统疾病。［7-9］条件。有研究报道，培养基中添加MnCl2，可以达到降1.2主要试剂及仪器低Man5水平的目的;增大培养基渗透压，Man5水平会基础培养基CD-CIM1由美国Invitrogen公司生产;补料［10］升高。培养基BF(BalancedFeed#1AGT)

7、、FS(FeedSupplement本实验从细胞培养条件反应器工艺参数出发，运用试v3)购自美国Lifetech.公司，CB4(CellBoost4)购自美国验设计(DOE)的方法，快速高效的建立反应器生产工艺，降Hyclone公司;生物反应器购自荷兰Applikon公司;二氧化低抗体生产过程中的Man5水平。前期实验的3L反应器碳摇床(ISF-1-X)购自瑞士Kuhner公司;细胞计数仪Cedex工艺参数为pH6.95、溶氧(DO)60%、温度(T)32.5℃、搅购自瑞士Ｒoche公司;UPL

8、C(超高效液相色谱)购自美国拌转速200r/min，收获时抗体表达量为764mg/L，Man5水Waters公司。收稿日期:2017-03-13修回日期:2017-05-03作者简介:徐菲菲(1985-)，女，江苏南通人，复旦大学生命科学学院工程硕士研究生，生物工程专业，E-mail:xufeifei@walvax.com。*通讯作者:徐水清，男，嘉和生物药业有限公司上游工艺开发总监，E-mail:xushuiqing@walvax.com;周新华，男，博士，嘉和生物药业有限公司首席执行管，E-