生物样品超薄切片技术

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1、生物样品常规制样技术超薄切片技术负染色技术扫描样品制作技术透射电镜特殊制样技术冷冻蚀刻技术电镜细胞化学技术免疫电镜技术X射线微区分析技术第四章透射电镜生物样品制备技术第一节载网和支持膜第二节超薄切片的制作第三节负染色技术第一节载网和支持膜一、载网：用于承载样品的(直径为3mm)网状材料。1.载网的类型及选择：非金属网：载网金属网铜网：惰性网：70％的透过率2.载网的清洗：酸碱法或有机溶剂、蒸馏水等洗净干燥。X射线元素分析常规超薄切片(200目以上)细胞化学二、样品支持膜为了增强样品的强度，在载网表面先覆一层薄膜。1.对膜的要求：本身没有结构，薄而透明，电子束易通过；有足

2、够的机械强度，经得住电子束的轰击；不与样品发生化学反应。厚度在10～15nm2.常用支持膜及其制备福尔莫瓦膜（Formvar):化学名称：聚乙烯醇缩甲醛.特点：机械强度高，制作简便.制作：0.2～0.5％的氯仿溶液，玻璃片汆出,水面剥离法。火棉胶膜：1~2%醋酸戊脂溶液，平皿沉淀法。碳膜：稳定性好，高分辨制样。操作方法0.2~0.5%的氯仿溶液蒸馏水膜1.福尔莫瓦支持膜的制作方法2.火棉胶膜用平皿水面展开法：平皿中盛有双蒸馏水，滴两滴1~3%的火棉胶膜液，待片刻溶剂挥发后，在膜上摆放洁净的铜网，滤纸捞起。3.碳膜制作：用真空喷镀法制膜。第二节超薄切片的制作超薄切片：是指厚

3、度小于100(50~70)纳米的切片。要求：厚薄均匀、厚度符合标准；无皱褶刀痕、震颤和沉淀；细胞结构保存良好，具有良好的电子反差；具有一定程度的机械强度。制作流程：包括六大步，40多次操作取材→固定→脱水→包埋→切片→染色→镜检超薄切片制作流程图0~4℃室温23237~60℃染色观察聚合修块切片捞片取材固定漂洗50%70%80%包埋90%95%100%过渡浸透一、取材从动、植物机体上或细胞及微生物培养物中获取所需要的研究材料的操作过程。1.取材的原则要求：准、快、小、冷、轻五字原则。准确：根据研究目的确定取材部位，取到典型部位。快速：材料离体后应在1分钟内投入固定液。体积

4、小：固定液渗透力所限，样品体积为1mm³或1×3mm长条。低温：固定液及器材需预冷(0~4℃)，以降低自溶酶的活性。防损伤：器械要锋利，切割轻巧，防挤压、牵拉损伤组织细胞的内部结构。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检2.取材方法：动物材料的获取：急性处死或麻醉后，在1～2分钟解剖出所需材料，切成标准块立即投入固定液，低温(0～4℃)保存；特殊难取的材料必须原位固定或灌流固定，再取材投入固定液。植物材料的获取：注意部位和方向性。叶片切取1×3㎜长条；根、茎切取标准块；表面有毛刺的材料先用酶处理使之软化，表面有蜡质的叶片先脱蜡，蒸馏水洗净后再取材固定。悬浮样品的获取：加

5、入适量固定液悬浮固定后，低速离心收集成团块再固定。需抽气使样品沉底保低温野外取材：携带冰壶保存固定液和材料，确保动物材料的现场固定；植物材料可保湿带回实验室再取材固定。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检二、固定用化学或物理的方法迅速杀死细胞的过程1.固定的目的：在分子水平上真实地保存组织细胞生活状态的细节，尽量减少细胞的死后变化。2.固定的类型：固定物理固定法：化学固定法：3.固定液的作用：迅速均匀渗透到细胞内部，稳定各种细胞成分；破坏细胞的酶系统，阻止细胞的自溶；通过化学作用建立分子交联，形成细胞骨架；提供一定的电子反差。超低温快速冷冻固定法使用化学试剂快速杀死细

6、胞取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检1~2.0%4.常用固定剂及其特点醛类：甲醛、戊二醛、多聚甲醛和丙烯醛戊二醛：穿透力强，能很好固定蛋白质和糖元、保存核酸、核蛋白，对微管、内质网等细胞膜系统保存较好；不能保存脂类物质，无电子染色作用。配制方法：常用0.1M的磷酸盐缓冲液(pH6.8~7.2)配成2.0～5.0％。选用：单细胞微生物动物组织植物组织厚壁组织浓度高5.0%锇酸(OsO4)是唯一能保存脂肪的固定剂，具有电子染色作用。能固定脂蛋白、核蛋白，不能保存核酸和糖类。取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检5.固定方法：(1)单固定法：用于易于渗透的材料和酶的细胞

7、化学(2)双固定法：戊二醛—锇酸双重固定(3)原位固定法：用于难解剖的、对缺氧敏感的组织器官，在保持血液供应的状态，边解剖边滴加固定液，待组织适度硬化后再取材作常规固定。(4)灌流固定：常用醛类固定：用于脑组织、植物叶片的气孔状态等通过血液循环的途径，将固定液灌注到相应部位，待组织适度硬化后再解剖取材，作常规固定。用于解剖关系复杂的组织（神经组织、脑垂体）戊二醛取材↓固定↓脱水↓包埋↓切片↓染色↓镜检直接影响被固定细胞的原有特定形态6.影响固定效果的因素(1)固定液的酸碱度：固定液的酸碱度必须与被固定材料的酸碱度基本一致。例如