免疫实验设计

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1、一、课题名称：细胞因子诱导的杀伤细胞对淋巴瘤荷瘤鼠的抗肿瘤作用的研究二、立题依据：恶性肿瘤是危害人类健康的严重的疾病之一，近年来恶性肿瘤的发病率呈逐渐上升趋势。随着分子生物学研究的不断深入和综合治疗方法的不断完善，肿瘤的诊治水平得到了很大的提高。目前，生物治疗已成为继手术、化疗及放疗之外的第四种治疗肿瘤的手段，是目前研究肿瘤治疗的热点之一。迄今为止，CIK细胞对淋巴瘤细胞株体外研究的报道较多，但对荷瘤鼠的体内研究及CIK细胞对肿瘤血管生成的影响研究较少。三、实验目的：细胞因子诱导的杀伤细胞是一种异质细胞群，从外周血、骨髓或脐带血中分离出的单个核细胞在

2、多种刺激因子（IL-2、IL-1、IFN-γ、抗CD3单克隆抗体）作用下,经过一定时间的培养而获得的一种免疫活性细胞。CIK细胞同时具有T细胞的抗肿瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤的特点。因其在体外扩增速度快，杀伤活性高，杀瘤谱广，不良反应少，可提高患者的免疫功能，消除微小残留，被认为是抗肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。本实验通过应用CIK细胞治疗淋巴瘤荷瘤鼠，应用免疫组化法比较治疗组与对照组的淋巴瘤组织的VEGF、MVD的差异，探索CIK细胞抗肿瘤的新机制，为CIK细胞在儿童淋巴瘤的临床应用提供依据。四、实验对象：淋巴瘤荷瘤鼠。建立淋巴瘤荷瘤鼠

3、并分组：在Balb/c-nu/nu裸鼠左上肢肩胛处皮下接种T细胞淋巴瘤Jurkat细胞1.2×108/ml，0.2ml/只。建立淋巴瘤荷瘤鼠模型。待裸鼠成瘤后，随机分为两组，每组5只，治疗组予瘤旁注射体外培养2周的CIK细胞3×107/ml，0.2ml/只，对照组予瘤旁注射0.2ml的生理盐水，隔日注射1次，连续注射3次。五、实验材料:1.试剂及仪器：RPMI-1640培养基、胎牛血清、二甲基亚砜、注射用链霉素、基因重组人IL-2、鼠抗人CD3Mcab、基因重组人INF-γ、人淋巴细胞分离液、兔抗人VEGF多克隆抗体、兔抗人vWF因子相关抗原抗体、生

4、物素标记抗兔IgG抗体、DAB显色液检测试剂盒、SP检测试剂盒。2.实验动物：实验动物为Balb/c-nu/nu裸小鼠，雄性，3-4周龄，体重14-16g，实验鼠饲养于无特定病原体动物（SPF）环境下，室内定期进行紫外线照射，鼠笼，饮水，垫料，饲料均高压消毒。六、实验方法及步骤:1.肿瘤细胞的培养及传代将Jurkat细胞常规培养于含10%的灭活胎牛血清（FBS），100U/ml的青霉素，100μg/ml的链霉素的RPMI-1640培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养，每2~3天传代一次，调整细胞浓度约5×106/ml，取对数生长期细

5、胞进行实验。2.CIK细胞的制备及体外扩增取健康人的外周血50ml，用肝素抗凝，加入等体积无血清培养基混匀后，小心加于50ml淋巴细胞分离液的液面上，保持液平分离液面2500r/min离心30min，收集第二层细胞，用无血清培养基洗涤2次后即得外周血单个核细胞，细胞被重悬并保存于RPMI-1640，10%人血清，2mmol/L谷氨酰胺，100U/ml青霉素，100ug/ml链霉素，50umol/L2-巯基乙醇组成的培养液中，第l天加入INF-γ2000U/ml，置于37℃，5％CO2，饱和湿度条件下培养24h，然后加CD3Mcab59/ml，rhlL

6、-21000U/ml，继续培养，每3天半量换液，同时补加rhIL-21000U/ml，调整细胞密度为1×106／ml，第l4天获取细胞。3.建立淋巴瘤荷瘤鼠模型并分组将Jurkat细胞离心、计数，用PRMI-1640培养基将细胞重悬，Balb/c-nu/nu裸小鼠左上肢肩胛处皮下接种T细胞淋巴瘤Jurkat细胞1.2×108/ml，0.2ml/只。建立淋巴瘤荷瘤鼠模型。待裸鼠成瘤后，建立淋巴瘤裸鼠模型。制模后第5天接种部位出现结节，其质地较硬，活动，认定成瘤。第3周时将荷瘤鼠按随机数字表随机分为两组(各5只)，对照组与CIK细胞治疗组，两组荷瘤鼠分别

7、于第1、3、5天瘤旁注射生理盐水、CIK细胞共三次。4.杀鼠取瘤治疗2周后将荷瘤鼠颈椎脱位法处死，完整的剥离肿瘤组织，用游标卡尺测量肿瘤的长短径，按公式(体积=长径×短径2/2)计算肿瘤体积大小。计算肿瘤生长抑制率。抑瘤率(％)=〔1-实验组肿瘤重量(或体积)/对照组肿瘤重量(或体积)〕×100％。5.肿瘤组织行免疫组化S-P法取对照组、实验组的肿瘤组织标本，10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，进行常规病理切片，采用S-P法进行免疫组化染色。七、预期结果及结论:1.预期结果：实验组淋巴瘤荷瘤鼠的肿瘤体积明显小于对照组；免疫组化结果显示，经过CIK细胞治

8、疗后，淋巴瘤组织中的VEGF表达减少对照组相比，实验组淋巴瘤组织中的新生血管明显减少；与对照组相比，实验组淋