提取与沉淀分离技术

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1、第一章提取与沉淀分离技术生物物质，尤其是生物大分子物质：蛋白质（包括酶），核酸，脂类，糖类等生物大分子的制备分四个阶段：选择材料和预处理细胞的破碎及细胞组分的分离提取和纯化浓缩，干燥和保存1生物大分子物质及其性质生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。许多生物大分子在生物材料中的含量极微，分离纯化的步骤繁多，流程长。许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的

2、综合影响，很难准确估计和判断2动物，植物，微生物都可作为制备生物大分子的原材料，所选用的材料主要依据试验目的来确定。有效成份是指欲纯化的某种单一的生命大分子物质。而有效成分以外的其它物质则统称杂质。生物材料的选择3在动、植物和微生物材料中，有效成分的含量一般较少；稳定性较差，大多数对酸、碱、高温和高浓度有机溶剂等因子较敏感；易被微生物分解变质。材料的采集会大大影响实验的成败,选用的材料不同，有效成分的含量就不同；同一材料的部位或生长期不同，有效成分的含量也不尽相同。总的来说，材料选择应遵循的原则是，有效成分含量多、稳定性好；来源丰富、保

3、持新鲜；提取工艺简单、有综合利用价值等。41、动物脏器：冰冻：-10℃冰库（短期保存）-70℃低温冰箱（数月）干燥：可长期保存2、植物组织：10小时内置-4--30℃冰箱储藏备用3、微生物：胞外产物（如发酵液），低温短时储藏。胞内产物，则应收集菌体或细胞，制成冻干粉于4℃保存（数月不变质）除了体液和微生物胞外的某些蛋白质和多肽以外,大多数生物大分子都存在于细胞之内.为了将细胞内的生物大分子提取和分离,就得将细胞或组织破碎.生物材料处理51、动物组织：选材：必须选择有效成分含量丰富且易分离的脏器组织为原材料。如磷酸单酯酶，从含量看，虽然

4、在胰脏、肝脏和脾脏中较丰富，但是因其与磷酸二酯酶共存，进行提纯时，这两种酶很难分开。所以实践中常选用含磷酸单酯酶少，但几乎不含磷酸二酯酶的前列腺作材料。脱脂：脏器中含量较高的脂肪，容易氧化酸败，导致原料变质影响纯度操作和制品的率。常用的脱脂方法有：人工剥去脏器外的脂肪组织；浸泡在脂溶性的有机溶剂（丙酮，乙醚）中脱脂；采用快速加热（50℃左右），快速冷却的方法，使溶化的油滴冷却后凝聚成油块而被除去。6保存：对预处理好的材料，若不立即进行实验，应冷冻保存。冰冻：剥去脂肪和筋皮等结缔组织，短期保存：－10℃的冰箱内；长期保存：－70℃低温冰箱

5、内。干燥：对于像脑垂体一类小组织，可置丙酮液中脱水，干燥后磨粉储存备用；对于含耐高温有效成分（如：肝素）的肠粘膜，可在沸水蒸煮处理，烘干后能长期保存。冰箱的除霜循环，可能对细胞造成伤害，要特别小心。解冻时要越快越好，但避免局部过热。72、植物材料：选材：注意植物品种和生长发育状况不同，其中所含生物大分子的量变化很大，另外与季节性关系密切。种子须泡胀或粉碎才可使用。含油脂较多的也要进行脱脂处理。a.提取核DNA：选用黄化苗（生长7－10天小麦，水稻），防止叶绿体DNA的干扰b.提取RNA：根据实验目的选用生长幼嫩组织为好。保存：冷冻采样后

6、尽快放于－4℃――20℃冰箱内。DNA,RNA采样后，用液氮速冻，至－70℃冰箱。对RNA样，如不立即使用，冷冻保存尤为重要。83.微生物：选材：应注意它的生长期，在微生物的对数生长期，酶和核酸的含量较高，可以获得高产量，以微生物为材料时有两种情况：利用微生物菌体分泌到培养基中的代谢产物和胞外酶等。一般用离心法收集上清液，上清液只能在低温下短期保存利用菌体含有的生化物质，如：蛋白质，核酸和胞内酶等。需破碎菌体细胞分离，湿菌体可低温短期保存，冻干粉可在4℃保存数月。39第一节细胞破碎细菌细胞结构细菌细胞壁的主要成分：肽聚糖磷壁酸脂多糖蛋白

7、质等10第一节细胞破碎细菌细胞结构结构革兰氏阳性菌革兰氏阴性菌坚韧度较坚韧较疏松肽聚糖含量较厚，可达50层，约占细胞壁干重的50%以上较薄，约占细胞壁干重的10%左右磷壁酸有无及含量有，约占细胞壁干重的50%无外膜（含脂多糖、脂质双层、脂蛋白）有无及含量无约占细胞壁干重的80%。11第一节细胞破碎酵母细胞结构外层：甘露聚糖（约占30%，以α-糖苷键联结（并非所有酵母菌都有）内层：葡聚糖（约占30-40%，由D-葡萄糖以β-糖苷键联结）中间层：蛋白质（含6-8%，多为酶类）细胞壁壁外成分：有些菌壁外含有由多糖构成的类似荚膜的结构。包括异多

8、糖、甘露聚糖和淀粉类物质。细胞壁的少量组分—脂类和几丁质几丁质（chitin)：为聚乙酰氨基葡萄糖几丁质并不是所有的酵母菌中都有，其含量也因种而异。裂殖酵母一般不含几丁质，酿酒酵母含1～2%，有的假菌丝酵母