怎样选择色谱柱液相色谱柱的种类与方法开发

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1、液相色谱柱的选择和方法开发奥秘科技/AUMITechnologies（US）内容概要色谱基本概念回顾色谱柱类型、选择和方法开发色谱基本概念回顾色谱（chromatography）色谱原理色谱分类：气相/液相和高效液相（HPLC）；反相/正相/离子交换/HILIC/混合固定相色谱功能：分析（种类/定量），纯化液相色谱仪器结构及功能：泵，脱气机，混合器，进样器（阀），色谱柱，柱温箱，检测器（流通池）分离度Rs-ResolutionN–TheoreticalPlateNumberα–Selectivityk–RetentionFactor拖尾1.Separa

2、tionofCompoundsAandB灵敏度ＬＯＤ：LimitofDetectionＬＯＱ：LimitofQuantification－柱效－峰形（拖尾因子）重现性分离度（Ｒ）－保留时间（Ｖ，Ｔ，Ｋ）－选择性（α）－柱效　（Ｎ）灵敏度色谱柱类型、选择和方法开发色谱柱与色谱条件对色谱性能的影响分离度《-选择性〈键合类型，基质表面特性；流动相、温度-柱效〈保留体积，粒径，柱长，基质表面特性；流动相，温度，上样量，流速峰对称性《基质表面特性，键合类型，流动相，温度保留体积《柱长，孔隙率，比表面积，基质表面特性，键合类型；流动相，温度灵敏度《粒径，基质表面特

3、性，键合类型；流动相，温度稳定性和重现性《基质表面特性，键合类型；流动相，温度流动相《pH，缓冲盐种类，溶剂；影响色谱柱性能的主要因素1、色谱柱的构型色谱柱内径色谱柱长度2、固定相柱填料粒径比表面积孔径孔隙率基质表面特性：-表面活性：硅胶纯度、硅羟基的酸性、均匀性和数量-耐碱性键合类型-官能团、是否封尾-键合相的保留行为、耐酸性色谱柱的构型对色谱柱性能的影响色谱柱的构型对色谱柱性能的影响：长度和直径色谱柱尺寸对色谱分离的影响：•短柱(15-100mm)-运行时间短,柱压低•长柱(150-250mm)-分辨率高,运行时间长•窄径柱(2.1mm)–满足检

4、测器和样品量限制•宽径柱(3-7.8mm)-载样量高，抗污染，寿命制备柱(内径>10mm)–用于纯化制备柱填料对色谱柱性能的影响柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径硅胶粒径和类型对柱效的影响d硅胶粒径和类型对压力的影响柱填料对C18色谱柱性能的影响：粒径II目前市场主要可供选择的填料粒径1.7μm，1.8μm，2.2μm－快速液相色谱柱：匹配快速色谱仪2.7μm－多孔壳层：在常规液相色谱仪上实现快速分离(Halo)3.0μm，3.5μm－普通快速分析5.0μm－常规分析颗粒越小，柱效越高,但是耐污染性能下降，柱压升高.柱填料对C18色谱柱性能的影响：比

5、表面积每克填料的表面积，与粒度，孔径有关比表面积大，保留增加，载样量增加，平衡时间增加(梯度洗脱尤为注意)根据需要选择合适的比表面积柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径I多孔材料的95%以上表面在孔内部样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部孔径至少是样品流体学直径的4倍300Ǻ孔径用于：超过50个氨基酸的肽或25个残基的低聚寡核苷酸样品分子直径小于平均孔径，才能进入微粒内部柱填料对C18色谱柱性能的影响：孔径II由于小孔径填料比表面积大，小分子的保留值在小孔径填料通常更大条件：C8色谱柱，4.6×150mm，3.5um，A溶剂，0.1%TFA水溶液

6、；B溶剂，0.1%TFA于80%乙腈－水中；20min梯度，1030%B；60°C，1.5ml/min柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度I2.3-二羟基萘2.7-二羟基萘TF=1.31BrandW,AQColumn5μm,4.6mm×150mmBrandZ,C18Column5μm,4.6mm×150mmVenusilMPC185μm,4.6mm×150mmBrandH,C18Column5μm,4.6mm×150mmBrandU,C18Column5μm,4.6mm×150mm！TF=1.42TF=1.39TF=1.69TF=？流动相：甲醇：水

7、=65：35流速：1mL/min温度：35℃检测波长：230nm进样量：20μL硅胶纯度－金属含量硅胶基质类型及发展史TypeA：原料来源：水玻璃；高金属含量，高活性，极性化合物容易形成拖尾和死吸附TypeB：原料来源：有机硅烷（四乙氧基硅烷）水解/烧结/酸洗杂化及表面杂化整体柱壳层柱柱填料对C18色谱柱性能的影响：硅胶纯度II硅胶纯度－金属含量d固定相对色谱柱性能的影响：硅羟基的影响残余硅羟基的影响普通硅胶当流动相的pH值大于4.5-5.0时，表面的硅羟基会带负电荷，碱性化合物拖尾。解决方法封尾双层表面修饰表面杂化固定相对色谱柱性能的影响：残余硅羟基

8、的影响封尾键合填料与小硅烷进行后续反应，如三甲基氯硅烷，反应掉部分残余硅羟基，以增加表面覆盖率