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时间:2019-06-25
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1、实验八、紫外吸收法检测DNA的浓度与纯度一、实验目的学会利用紫外分光光度计测定样品的吸光度,从而测出DNA的浓度与纯度。二、实验原理DNA的吸收峰在260nm,蛋白质的吸收峰在280nm。1μg/ml标准DNA样品A260=0.02,因此,A260=1时,双链DNA含量为50μg/ml;单链DNA与RNA含量为40μg/ml;寡聚核苷酸的含量为30μg/ml。一般来说,纯净的DNA其A260/A280的比值约为1.8,大于1.8表明样品中RNA污染严重,小于1.6说明有蛋白质或苯酚污染;纯净的RNAA260/A280的比值约为2.
2、0,在样品中若含有蛋白质,会使A260/A280的比值下降。三、实验材料紫外分光光度计、比色皿、移液枪、实验七中获得的质粒DNA四、实验步骤1、选取合适的按键。待测定样品为dsDNA(如PCR产物),按下键“7/dsDNA”。待测定样品为ssDNA(如反转录合成的第一链cDNA产物),按下键“8/ssDNA”。待测定样品为RNA,按下键“9/RNA”。待测定样品为Oligo(如PCR引物),按下键“6/Oligo”。2、将空白对照置入样品孔。注意:空白对照是空白液,并非所有情况都是水。例如,用Tris溶液溶解DNA样品,则要用Tr
3、is液做空白对照。3、按下“Blank”键。仪器记录空白对照,设置为0.000A。4、将样品置入样品孔,按下“Sample”键,仪器显示样品的吸光度和浓度值,以及其他相关参考比值。五、实验结果与分析A260/A280=1.118,DNA浓度86.45。A260/A280小于1.6,说明蛋白质或苯酚污染严重,这可能是在制备质粒DNA时加入的酚/氯仿不足,或加入酚/氯仿后没有混合均匀等原因。DNA浓度偏低,可能是实验的多次弃上清过程中存在损耗。六、思考题问:利用紫外-可见分光光度计测得的结果比实际浓度偏高还是偏低?为什么?答:核酸在波
4、长260nm处有最高吸收峰。吸收紫外光的性质是嘌呤环和嘧啶环的共轭双键系统所具有的,所以嘌呤和嘧啶以及一切含有它们的物质,不论是核苷、核苷酸或核酸都有吸收紫外光的特性。但紫外法不能区分DNA和RNA,只能用来鉴定核酸的纯度和含量,故结果偏高。
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