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时间:2019-06-24
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1、第二章蛋白质的理化性质及其分离和提纯一、氨基酸的性质(一)两性与等电点水溶液中存在如下平衡:具有酸碱性两性离子阴离子偶极离子阳离子注意:氨基酸在等电点时的pH值不等于7。一般,酸性氨基酸等电点pI为:2.8~3.2中性氨基酸等电点pI为:5.0~6.5碱性氨基酸等电点pI为:7.58~10.8等电点时,氨基酸的溶解度最小。(分离和提纯)等电点(pI):氨基酸以偶极离子形式存在时的pH值。(isoelectricpoint)pH=pI时,以偶极离子形式存在pH>pI时,以阴离子形式存在pH2、在电场中的移动速度也就不同。借此可以进行氨基酸的电泳分离。纸电泳(Paperelectrophoresis)练习:现在有四个氨基酸:苯丙氨酸pI=5.5、脯氨酸pI=6.3、天冬氨酸pI=2.8和赖氨酸pI=9.7,请问在以下pH条件下进行电泳,各氨基酸的主要存在形式是什么?在外电场作用下,移向阳极还是阴极?苯丙氨酸脯氨酸门冬氨酸赖氨酸(1)pH=7.0(2)pH=6.0(3)pH=5.0(4)pH=2.0正阴极正阴极负阳极正阴极负阳极负阳极负阳极正阴极正阴极正阴极正阴极正阴极负阳极正阴极负阳极正阴极基于aa所带基团均可解离;酸碱滴定法;得到弱酸弱碱曲线;根据aa上可解离基团的pK值计算等3、电点:pK:解离常数。pI的测定以甘氨酸为例:R-R+R±等电点的计算K1=[R±][H+][R+]K2=[R+][R-][H+]由式可知解离常数:两边取负对数:-lg[H+]2=-lgK1--lgK2∵-lg[H+]=pH-lgK1=pK1-lgK2=pK2∴2pH=pK1+pK2令pI为等电点时的pH,则pI=½(pK1+pK2)Gly:pI=½(2.4+9.6)=5.97由此可知:等电点相当于该aa两性离子状态两侧基团pK值之和的一半。对侧链R基不解离的中性氨基酸:pI=1/2(pK1+pK2)即:等电点pH值与离子浓度无关,只取决于兼性离子两侧基团的pK值。对有三个可解离基团的氨4、基酸:如:酸性氨基酸、碱性氨基酸的pI计算:a、先写出其解离公式;b、后取兼性离子两侧基团的pK值的平均值。如:天冬氨酸如赖氨酸:(二)氨基酸的脱羧反应(三)与亚硝酸反应范斯莱克(VanSlyke)氨基氮测定法:根据所得氮气体积,算出氨基酸含量。(四)受热反应(1)α-氨基酸受热交酰胺(主要产物)二肽(少量)交酰胺经盐酸或碱处理,可转变成二肽(2)β-氨基酸受热(3)γ或δ-氨基酸受热生成较稳定的五元环或六元环的内酰胺。(4)氨基与羧基相隔5个或5个以上碳原子(五)与茚三酮反应大多数α-氨基酸与茚三酮反应呈蓝紫色,这是鉴别α-氨基酸最灵敏、最简便的方法。α-氨基酸与茚三酮反应所生成蓝紫化合5、物在570nm有强吸收,可进行比色分析,其吸收强度与氨基酸的含量成正比,因此可作氨基酸的定量分析。天然蛋白质分子的20种氨基酸,以色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有较强的光吸收。其吸收峰在280nm左右,以色氨酸吸收最强。可利用此性质采用紫外分光光度法测定蛋白质的含量。紫外吸收性受溶液pH的影响。(六)紫外吸收性质二、蛋白质的性质(一)两性电离与等电点含有羧基及氨基,因此可以两性电离,存在等电点(pI)等电点时,蛋白质的溶解度、粘度、渗透压、膨胀性都最小,在电场中不移动。同样,当溶液pH=pI时,蛋白质所带正、负电荷相等;当溶液pH>pI时,蛋白质带净负电荷;当溶液pH<pI时,蛋白质带净6、正电荷。蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。(二)胶体性质蛋白质颗粒的直径1~100nm,属于胶体溶液。因此,蛋白质具有亲水溶胶的性质。布朗运动、弱丁达尔效应、不能透过半透膜、吸附透析法(dialysis)提纯蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜+++++++带正电荷的蛋白质--------带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质++++++++带正电荷的蛋白质--------带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用物理因素:加热、高压、搅拌、X-射线、紫外线、超声波化学因素:强酸、强碱、脲、重金属盐、有机溶剂、生物碱等1、变性在某些物理或化学因素7、的作用下,蛋白质严格的空间结构被破坏(不包括肽键的断裂),从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变。实质:破坏次级键,改变其构象(三)蛋白质的变性与沉淀变性蛋白质的性质改变:①物理性质:旋光性改变,溶解度下降,沉降率升高,粘度升高,光吸收度增加等;②化学性质:官能团反应性增加,易被蛋白酶水解。③生物学性质:原有生物学活性丧失,抗原性改变。蛋白质变性的可逆性:①蛋白质在体外变性后,绝大多数情况下是不能复性的;②如变性程
2、在电场中的移动速度也就不同。借此可以进行氨基酸的电泳分离。纸电泳(Paperelectrophoresis)练习:现在有四个氨基酸:苯丙氨酸pI=5.5、脯氨酸pI=6.3、天冬氨酸pI=2.8和赖氨酸pI=9.7,请问在以下pH条件下进行电泳,各氨基酸的主要存在形式是什么?在外电场作用下,移向阳极还是阴极?苯丙氨酸脯氨酸门冬氨酸赖氨酸(1)pH=7.0(2)pH=6.0(3)pH=5.0(4)pH=2.0正阴极正阴极负阳极正阴极负阳极负阳极负阳极正阴极正阴极正阴极正阴极正阴极负阳极正阴极负阳极正阴极基于aa所带基团均可解离;酸碱滴定法;得到弱酸弱碱曲线;根据aa上可解离基团的pK值计算等
3、电点:pK:解离常数。pI的测定以甘氨酸为例:R-R+R±等电点的计算K1=[R±][H+][R+]K2=[R+][R-][H+]由式可知解离常数:两边取负对数:-lg[H+]2=-lgK1--lgK2∵-lg[H+]=pH-lgK1=pK1-lgK2=pK2∴2pH=pK1+pK2令pI为等电点时的pH,则pI=½(pK1+pK2)Gly:pI=½(2.4+9.6)=5.97由此可知:等电点相当于该aa两性离子状态两侧基团pK值之和的一半。对侧链R基不解离的中性氨基酸:pI=1/2(pK1+pK2)即:等电点pH值与离子浓度无关,只取决于兼性离子两侧基团的pK值。对有三个可解离基团的氨
4、基酸:如:酸性氨基酸、碱性氨基酸的pI计算:a、先写出其解离公式;b、后取兼性离子两侧基团的pK值的平均值。如:天冬氨酸如赖氨酸:(二)氨基酸的脱羧反应(三)与亚硝酸反应范斯莱克(VanSlyke)氨基氮测定法:根据所得氮气体积,算出氨基酸含量。(四)受热反应(1)α-氨基酸受热交酰胺(主要产物)二肽(少量)交酰胺经盐酸或碱处理,可转变成二肽(2)β-氨基酸受热(3)γ或δ-氨基酸受热生成较稳定的五元环或六元环的内酰胺。(4)氨基与羧基相隔5个或5个以上碳原子(五)与茚三酮反应大多数α-氨基酸与茚三酮反应呈蓝紫色,这是鉴别α-氨基酸最灵敏、最简便的方法。α-氨基酸与茚三酮反应所生成蓝紫化合
5、物在570nm有强吸收,可进行比色分析,其吸收强度与氨基酸的含量成正比,因此可作氨基酸的定量分析。天然蛋白质分子的20种氨基酸,以色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸对紫外光有较强的光吸收。其吸收峰在280nm左右,以色氨酸吸收最强。可利用此性质采用紫外分光光度法测定蛋白质的含量。紫外吸收性受溶液pH的影响。(六)紫外吸收性质二、蛋白质的性质(一)两性电离与等电点含有羧基及氨基,因此可以两性电离,存在等电点(pI)等电点时,蛋白质的溶解度、粘度、渗透压、膨胀性都最小,在电场中不移动。同样,当溶液pH=pI时,蛋白质所带正、负电荷相等;当溶液pH>pI时,蛋白质带净负电荷;当溶液pH<pI时,蛋白质带净
6、正电荷。蛋白质分子表面的水化膜和表面电荷是稳定蛋白质亲水溶胶的两个重要因素。(二)胶体性质蛋白质颗粒的直径1~100nm,属于胶体溶液。因此,蛋白质具有亲水溶胶的性质。布朗运动、弱丁达尔效应、不能透过半透膜、吸附透析法(dialysis)提纯蛋白质颗粒的表面电荷和水化膜+++++++带正电荷的蛋白质--------带负电荷的蛋白质在等电点的蛋白质++++++++带正电荷的蛋白质--------带负电荷的蛋白质不稳定的蛋白质颗粒酸碱酸碱脱水作用脱水作用脱水作用物理因素:加热、高压、搅拌、X-射线、紫外线、超声波化学因素:强酸、强碱、脲、重金属盐、有机溶剂、生物碱等1、变性在某些物理或化学因素
7、的作用下,蛋白质严格的空间结构被破坏(不包括肽键的断裂),从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变。实质:破坏次级键,改变其构象(三)蛋白质的变性与沉淀变性蛋白质的性质改变:①物理性质:旋光性改变,溶解度下降,沉降率升高,粘度升高,光吸收度增加等;②化学性质:官能团反应性增加,易被蛋白酶水解。③生物学性质:原有生物学活性丧失,抗原性改变。蛋白质变性的可逆性:①蛋白质在体外变性后,绝大多数情况下是不能复性的;②如变性程
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