《液相层析色谱技术》PPT课件

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1、第五章低压液相层析（色谱）技术慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液液相色谱法：以液体为流动相的色谱法称～。经典液相色谱：固定相颗粒较大且不均匀常压下输送流动相柱效较低分析周期长现代液相色谱：固定相颗粒小且均匀高压下输送流动相柱效较高分析周期短特性经典LCHPLCHPLC优势进样人工加样进样器准确溶液流动重力高压泵快速分离,重现性好检测和定量收集馏分检测连续检测高灵敏度,自动化实验结果棒式图色谱图五高一广表11.1两种不同形式液相色谱的这样特征1、国产低压液相色谱系统国产常压液相色谱系统的组

2、成层析柱恒流泵核酸蛋白检测仪自动分部收集器记录仪一、低压液相色谱系统层析柱（a）自制简易层祈柱（1．玻璃管；2.橡皮塞；3．尼龙网）；（b）普通商品柱；（c）双底板层析柱（1.洗脱液进出口；2.多孔底板；3．柱床；4．恒温水进口；5．恒温水出口；6．可调节的塞子）层析柱：填料的充填恒流泵：提供稳定的液流紫外检测仪：信号检测部分收集器：样品的分部收集记录仪：记录信号BS－100自动部分收集器安装圈1．反全阀；2换管臂；3滴管；4，5换管臂固定螺丝；6.竖杆；7.竖杆囤定螓丝；8报警板；9.试管；10．收集

3、盘；11.时间选挥旋钮；12.时间选择固定螺钉；13．自动开关；14、指示灯；15.电源开关；16．换向开关（逆、顺）；17．手动开关层析系统连接示意图1．密封橡皮塞；2．恒压管，3，恒压瓶；4，层析流出液，5．可调蜾旋夹；6.自动收集器；7.核酸一蛋白质检测仪2、GEAKTAsystemsAKTAprimeAKTAexplorerAKTAFPLC3、Bioradsystems二、柱层析法的一般技术层析柱层析柱通常是玻璃的。总的说来，长柱分辨好。但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。一、层析材料的准备许多

4、材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡，另外还需作一些预处理。例如:凝胶层析材料需要溶胀，吸附剂需要加热或酸处理来活化离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。凝胶的前处理的方法溶胀：称取适量凝胶干粉，用约10倍蒸馏水浸泡24小时以上，待凝胶充分溶胀后，倾去上层悬浮物及蒸馏水。碱洗：用0.5MNaOH溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。酸洗：用0.5MHCl溶液浸泡半个小时，然后用蒸馏水洗至中性。平衡：用起始缓冲液浸泡凝胶，直至凝胶液pH与起始缓冲液相同。在用溶剂平衡时，先使材料

5、沉淀，用倾泻法除去悬浮的细颗粒，否则由于细颗粒的堵塞，溶剂的流速将显著降低。二、装柱装柱是最关键的一步。重力沉降法装柱陆续不断地添加糊状物，使其形成的胶粒床面上有胶粒连续均匀地沉降，直至装柱物完全沉降至适当的柱床体积为止。柱的表面始终要保持着一层溶剂(一般l～3cm柱高)柱的任何一部分绝对不能“流干”。层析柱的形状，一般直径与高度的比为l：15为宜。柱形必须根据层析介质和分离目的而定。待分离物质的性质相近，柱越细长，则分离效果越好，但流速较慢。在样品组分并不复杂的情况下，采用“矮胖柱”。三、平衡层析柱正

6、式使用前，必须平衡至所需的pH和离子强度，一般用起始缓冲液在恒定压力下走柱，其洗脱体积相当于3-5倍床体积，使交换剂充分平衡，柱床稳定。装好的柱必须均匀，无纹路，不含气泡，柱顶交换剂沉积表面十分平坦。检查柱是否均匀，可用蓝色葡聚糖2000，在恒压下走柱，如色带均匀下降，说明柱是均匀的，可以使用，否则应重新装柱四、加样量和加样体积加样量的多少和加样体积大小是影响分离效果的关键因素，加样量越少和加样体积越小，则分离效果越好。它主要取决于层析目的(分析性柱层析或制备性柱层析)，也与样品中种类多少，相对浓度及亲

7、和力有关。对于分析性柱层析，加样量一般不超过床体积0.5-1％，制备性柱层析加样量不超过1-3％。离子交换剂的加样量远远大于分子筛。如果要求高分辨率时，如分析性柱层析和精制要求高纯度产品时，则样品的体积尽可能小。1．样品的准备样品在上柱前必需经预处理，由于分离和制备的目的不同，预处理的方法也往往不同。一般使其与起始缓冲液有相同pH，低的离子强度和尽可能小的体积。预处理可酌情用超滤法、透析法和凝胶过滤法等进行浓缩和脱盐，样品中的不溶物在上样前用离心法或过滤法除去。2．加样方法有3种方法可将样品加到已制备好

8、的柱顶：1.简单的方法是放除柱床表面以上的溶液，然后小心地用移液管加样；保持柱上端胶面平整、柱内无气泡和胶床不干裂十分重要。为此，除加样时注意不破坏胶面平整外，在整个层析过程中，应在胶面上端保留合适体积的洗脱液(约1-2cm柱高)，避免洗脱液滴入柱内时，破坏胶面的平整或可能造成胶床干裂。2.不需要让柱流干至床表面，而是加入1％浓度的蔗糖来增加样品的密度；3.用一个毛细管和一个注射器或蠕动泵把样品直接传送到柱表面(如一些商品柱附有专门加样装置