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时间:2019-06-17
《抗植物毒素Pro.R单域抗体的五聚体构建、表达及生物活性鉴定》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、北京林业大学本科毕业论文抗植物毒素Pro.R单域抗体的五聚体构建、表达及生物活性鉴定生物技术03-2李阿茜指导老师阎锡蕴张德强摘要目的:建立单域抗体多聚化的技术平台,提高其与抗原的亲和力,以期实现单域抗体对毒素的高灵敏检测。方法和结果:从质粒pCANTAB5ES1中PCR扩增出特异识别植物毒素Pro.R的单域抗体S1的基因,亚克隆到五聚体载体pVT2中,构建重组表达质粒pVT2S1,再转化到E.coliTG1中。经westernblot鉴定了其正确表达,IPTG大量诱导后通过Ni-his亲和层析纯化,300mM咪唑溶液冼脱蛋白,获得了高表达的可溶性目的蛋白——pVT2S1。SDS—PAGE
2、分析显示表达的蛋白区带分子量约22kDa左右,与预期相符。ELISA结果表明,纯化的pVT2S1蛋白可特异性识别抗原Pro.R。由于pVT2载体上为5×his标签,与常用表达载体上6×his标签检测系统不同,为了统一单体VHH和五聚体VHH的检测标准,又进行了载体的改造,分别构建了pVT2S1(6×his)、空载体pVT2(6×his)和pETS1(单域抗体,N端为6×his标签),这些都为进一步研究VHH抗体的生物活性以及实际应用,如抗原的检测等奠定了较好的基础。结论:成功建立单域抗体多聚化的技术平台,实现了载体的统一检测标准,为高灵敏度检测毒素Pro.R奠定基础。关键词:Pro.R,单
3、域抗体,五聚体载体1北京林业大学本科毕业论文ConstructionofpentamerizedsingledomainantibodyagainsttoxinPro.RandidentificationofitsbindingactivityBiologyscienceandtechnology03-2AQian-LiSupervisorXiYun-YanDeQiang-ZhangAbstractObjective:SettingupaplatformforscreeningVHHantibody(variabledomainofheavychainofheavychainantibod
4、y),improvingtheaffinityofVHH,anddetectionthetoxininahighsensitivity.Methodsandresults:ThegeneofVHHS1thatspecificallyrecognizesplanttoxinPro.RwasamplifiedbyPCRfromplasmidpCANTAB5ES1.TheamplifiedfragmentswereclonedintopentamerizationvectorpVT2,andtherecombinantplasmidpVT2S1wastransformedintoE.coliTG
5、1.Afteridentificationofitsexpressionbywesternblot,TG1/pVT2S1wasinducedwithIPTG.ThetargetproteinexpressedinE.coliwaspurifiedbyNi2+Affinitychromatography(300mMimidizoneelution).SoweobtainedsolubleexpressiontargetproteinpVT2S1athighlevel.TheactivityofpurifiedtargetproteinpVT2S1wasidentifiedbyELISA.Th
6、ereisa5×histagonvectorpVT2,whileonnormalvectorsthereisa6×histag.ToconformthetestingstandardofpentavalentVHHandmonovalentVHH,wereconstructedvectors:pVT2S1(6×his)、freevectorpVT(26×his)andpETS1(monomerVHHwitha6×histagonNterminal).AlloftheaboveworkisintendedasabasisforfurtherstudyandapplicationofVHH,s
7、uchastestingofantigen.Conclusion:WehavesuccessfullysetuptheplatformforscreeningVHHantibody,standardizedthedetectiontagofpentamerandmonomer,andestablishedthefoundationoftoxinhighsensitivitydetection.Keywords:Pro.R
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