DNA复制、转录和翻译复习

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细胞与分子诊断系严永敏yym@ujs.edu.cn分子诊断学 内容提要《分子诊断学》是供高等医学检验专业本科学生使用的教材，也可供其他医学相关专业学生及医生参考。本书主要内容分为以下几个方面：（1）基础篇：着重描述了原核生物基因组、病毒基因组、真核基因组和蛋白质组等基础理论；（2）技术篇：介绍了生物大分子的分离纯化技术、分子克隆技术、DNA测序技术、PCR技术、核酸分子杂交技术、蛋白质组研究技术和生物芯片技术等；（3）应用篇：在探讨分子诊断的基本策略与方法的基础上，详细介绍了感染性疾病的分子诊断、单基因疾病的分子诊断、多基因疾病的分子诊断、移植配型、法医学鉴定、单核苷酸多肽型分析以及生物信息学在分子诊断中的应用。 实验1分子生物学基本操作与训练；实验2感受态细胞的制备，重组质粒导入大肠杆菌及重组子筛选；实验3重组质粒DNA的小量制备；实验4重组质粒DNA限制性内切酶的酶切与鉴定；实验5聚合酶链反应（PCR）及琼脂糖凝胶电泳；实验6基因组DNA的提取与鉴定；相关实验课程 复习DNA的复制、转录和翻译基因表达调控 DNA复制概念:半保留复制,半不连续复制(前导链,后随链),冈崎片段DNA复制的酶学DNA聚合酶(DDDP,多功能酶)起始阶段---获得单链模板解螺旋酶,拓扑异构酶,单链结合蛋白等 反转录(reversetranscription)以RNA为模板，合成与其互补的DNA的过程,也称逆转录。RNADNA反转录酶 ①RNA指导的DNA聚合酶活性（RDDP）。②核糖核酸酶H活性（RNaseH）。③DNA聚合酶活性（DDDP）。反转录酶的作用－合成cDNA：反转录酶（reversetranscriptase）是依赖RNA的DNA聚合酶，它以RNA为模板，4种dNTP为底物，催化合成DNA，此过程称为反转录过程。反转录酶是多功能酶。 5335RNA(用表示)RNA-DNA杂化分子35RNase（核酸酶H活性)DDDP（DNA聚合酶活性）4种dNTPRDDP（反转录酶）引物、4种dNTP病毒双链DNA用表示）（cDNA第二链(complementaryDNA，cDNA)与病毒RNA互补的DNA(用表示)53355353反转录酶的作用 转录(transcription)生物体以DNA为模板合成RNA的过程转录RNADNA 转录的条件：原料:4种NTP(ATP,UTP,GTP,CTP)模板:单链DNA酶:RNA聚合酶其他蛋白质因子复制与转录的异同?？ 转录起始RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域;DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板需解决两个问题： 模板和RNA聚合酶的辨认、结合5335结构基因调控序列RNA-pol——启动子（promoter)RNA聚合酶识别,结合并起始转录的一段高度保守性DNA序列，称为 保守序列（一致性序列）开始转录TTGACAAACTGT-35区(Pribnowbox)结合部位，影响启动子复合物形成；TATAATPuATATTAPy-10区1-30-5010-10-40-205335识别部位，还决定启动子强度；原核生物启动子（Sextama框）间隔区 原核生物的转录起始2DNA双链解开,形成转录空泡1RNA聚合酶全酶(2)与模板结合3在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应–5’-pppGpN–OH+ppiRNApol-DNA-pppGpN-OHpppGNTPpppGpN-OHppi起始复合物:5’-pppG-OH+NTP 53DNA原核生物转录过程中的现象核糖体RNARNA聚合酶 转录终止------RNA聚合酶在DNA模板上停止前进，转录产物RNA链从转录复合物上脱落下来原核生物的转录终止子（terminator）1、依赖ρ因子（Rho)的转录终止2、不依赖ρ因子的转录终止DNA模板上靠近终止处，有些特殊的碱基序列，转录出RNA后，RNA产物形成特殊的结构来终止转录。 TTGCAGCCTGACAAATCAGGCTGATGGCTGGTGACTTTTTAGTCACCAGCCTTTTTDNA或UUUU˙˙˙˙˙˙CAAUCAA茎环结构RNA 5’pppG5335茎环结构使转录终止：1，使RNA聚合酶变构2，使转录复合物趋于解离，RNA产物释放RNA-pol 真核生物的转录起始也需要RNA聚合酶辨认、结合转录起点，生成起始复合物。 -GCGC---CAAT---TATA转录起始TATA盒（-30～-25）CAAT盒(-75)GC盒(-90)基因增强子(enhancer)增强转录效率RNA聚合酶II启动子 DTATAABDNATATAFERNA聚合酶与模板DNA的结合需一系列转录因子(TF)的参与。RNA聚合酶 真核生物的转录终止——和转录后加工密切相关5’------AAUAAA-5’------AAUAAA--Poly(A)mRNA核酸酶-GUGUGUGAATAAAGTGTGTG转录终止的修饰点5’5’3’3’RNA-pol 真核生物的转录后加工内含子（intron）和外显子（exon） 蛋白质的生物合成——翻译 翻译（translation）是指以新生的mRNA为模板，把核苷酸的三联体遗传密码翻译成氨基酸序列，合成多肽链的过程，是基因表达的最终目的。 蛋白质生物合成体系模板：mRNA原料：20种编码氨基酸氨基酸运载体：tRNA场所：核蛋白体酶：氨基酰-tRNA合成酶、转肽酶蛋白质因子：起始因子（initiationfactors,IF;eIF）延长因子（elongationfactors,EF）释放因子（releasefactors,RF）核蛋白体释放因子（ribosomalreleasefactors,RRF） 一、mRNA是翻译的直接模板开放阅读框架（openreadingframe,ORF）mRNA从5’→3’方向，从起始密码到终止密码的序列，称为一个开放阅读框架。遗传密码（geneticcodon）开放阅读框架内每3个碱基组成的三联体，决定一个氨基酸，称为遗传密码。 遗传密码的特点（一）遗传密码的连续性（commaless）（二）简并性（degeneracy）（三）摆动性（wobble）（四）通用性（universal）（五）偏爱性 AUGUGAUAAUAG 二、核蛋白体是肽链合成的场所核蛋白体由大、小亚基组成，每个亚基含有不同的蛋白质和rRNA，原核生物和真核生物又各有不同。 SD序列（Shine-Dalgarno)原核生物特有的、位于mRNA上起始密码子上游的一段富含嘌呤（AGGA)碱基的短序列，是mRNA与核糖体小亚基结合位点，直接影响翻译效率，又称为核蛋白体结合位点（ribosomalbindingsite，RBS）。。 基因表达调控（controlofgeneexpression）基因表达的开启或关闭以及基因活性的增加或减弱等，受着调节和控制。基因表达(geneexpression)--通过转录及翻译产生蛋白质产物，或转录后直接产生RNA产物的过程。基因表达调控 顺式作用元件（cis-actingelement）－特异DNA序列可调节转录的DNA片段。－－非编码序列；包括启动子、增强子、终止子、沉默子等。反式作用因子（trans-actingfactor）－蛋白质与顺式作用元件直接或间接相互作用，能调节基因转录活性的蛋白质因子。包括转录因子，RNA聚合酶等。 反式作用因子（trans-actingfactor）激活蛋白(activatorprotein）促进转录；阻遏蛋白(repressorprotein)抑制转录；RNA聚合酶直接识别并结合启动子，解开DNA双螺旋，催化合成转录产物； 第二节原核生物基因转录调节原核基因转录调节特点操纵子模型的普遍性操纵子—一个转录单位RNA聚合酶对转录起始的调节调节蛋白对转录起始的调节 操纵子（operon）：原核生物的一段DNA序列，由几个串联排列的功能相关的结构基因，加上调控序列组成的一个完整的连续的功能单位。乳糖操纵子P：启动子O：操纵基因Z：β-半乳糖苷酶基因Y：通透酶基因A：乙酰基转移酶基因结构基因调控序列 细菌对乳糖的利用及其相关的酶:乳糖(在通透酶作用下进入细菌内）β半乳糖苷酶（细菌中少量存在）异乳糖β半乳糖苷酶（细菌中少量存在）葡萄糖+半乳糖β半乳糖苷酶（细菌中少量存在）转乙酰基酶--乙酰半乳糖 乳糖操纵子－细菌以葡萄糖为能量来源葡萄糖充分时（优先利用）：与葡萄糖代谢有关的酶基因---表达与其他糖代谢有关的酶基因---关闭葡萄糖耗尽时，乳糖存在：与乳糖代谢有关的酶基因---表达与葡萄糖代谢有关的酶基因---关闭 阻遏蛋白的负调控(negativecontrolofrepressor)无乳糖(nolactose):lac操纵子处于阻遏状态(repression) 乳糖代谢基因表达调控图解：(没有乳糖时)IＰＯlacZlacYlacA调节基因启动子操纵基因结构基因RNA聚合酶mRNA转录翻译阻遏蛋白与操纵基因结合，结构基因转录受阻．阻遏蛋白 有乳糖(presenceoflactose)lac操纵子被诱导(derepression,induction)诱导剂(inducer):异乳糖、半乳糖、IPTG（异丙基硫代半乳糖苷）1、半乳糖的正调控 乳糖代谢基因表达调控图解：(有乳糖时)IＰＯlacZlacYlacA调节基因启动子操纵基因结构基因RNA聚合酶mRNA转录翻译阻遏蛋白与别乳糖结合后构象发生了改变，因而不能与操纵基因结合，使得结构基因进行转录。阻遏蛋白别乳糖转录半乳糖苷酶通透酶乙酰转移酶 CAP的正调控（PositiveControlofCAP）CAP(cataboliteactivatorprotein)—分解代谢基因激活蛋白同二聚体(亚基22kD)，是一种重要转录调节蛋白。两个结合位点DNA结合域cAMP(cyclicAMP)结合位点 2、 乳糖操纵子(lacoperon)的调控方式 协调调节(coordinateregulation)负调控与正调控协调合作阻遏蛋白封闭转录时，CAP不发挥作用如没有CAP加强转录，即使阻遏蛋白从O上解聚仍无转录活性☆葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌优先利用葡萄糖葡萄糖可降低cAMP浓度，阻碍其与CAP结合从而抑制转录结论：lac操纵子强的诱导作用既需要乳糖又需缺乏葡萄糖