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1、中 国 生 物 工 程 杂 志第23卷第6期CHINABIOTECHNOLOGY2003年6月卡那霉素在植物转基因中的应用及3其抗性基因的生物安全性评价33王紫萱 易自力(湖南农业大学细胞工程重点实验室 长沙 410128)摘要 介绍了卡那霉素在转基因植物筛选中的作用机理及其在植物转化过程和转化后代中的应用现状。卡那霉素不仅在植物转化过程中可起到筛选作用,而且在转化后代中可通过其对后代进行遗传分析和测定种子纯度,同时还可用于后代田间成株的筛选。随着卡那霉素的广泛使用,卡那霉素抗性基因的安全性问题日益受到重视。概述了转基因植物的杂草化、卡那霉素抗性基因的水平扩散、抗
2、生素医疗安全性和食用安全性等方面的研究进展。关键词 卡那霉素 转基因植物 生物安全性 转基因植物中的外源基因主要有两大类,即目的影响,能正常生长、发育、分化,从而把转化体筛的基因和标记基因。标记基因是帮助对转基因生选出来。物工程体进行筛选和鉴定的一类外源基因,它包括卡那霉素能对转基因植物进行筛选实质上是通[1]选择标记基因和报告基因。在选择压力下,不含过卡那霉素抗性基因起作用的。卡那霉素抗性r标记基因及其产物的非转化细胞和组织死亡,而转(Kan)基因即新霉素磷酸转移酶基因(npt2Ⅱ),亦可化细胞由于有抗性,可以继续存活,因而有利于从称为氨基糖苷磷酸转移酶Ⅱ基因
3、(aph2Ⅱ),它来自大[1,2]大量的非转化细胞和组织中选择出转化克隆。肠杆菌(E.coli)的aphA2基因。是目前在植物基因目前,在植物转基因中使用的筛选剂主要有抗转化中应用最广泛的选择标记基因。它编码的产物生素类,除草剂类,氨甲喋呤,氨基酸类。在抗生素氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3′)Ⅱ—酶)能对氨基糖苷类中[3],主要有卡那霉素(kanamycin,Kan)、潮霉素类抗生素———卡那霉素具有抗性。此酶最早是从(hygromycin,Hyg),庆大霉素衍生物(geneticin,G418)细菌转座子Tn5中分离得到的,它的作用原理是:等,其中卡那霉素在植物
4、的遗传转化中是应用最早npt2Ⅱ基因产物通过酶促磷酸化使氨基糖苷类抗生最广泛的一种筛选剂。因此其筛选效果和抗性基素失效,从而解除毒性。因为卡那霉素能干扰一般因的生物安全性问题受到了人们的普遍关注。植物细胞叶绿体及线粒体的蛋白质合成,引起植物绿色器官的黄化,最终导致植物细胞的死亡。而转1 卡那霉素的作用机理基因植物由于含有卡那霉素抗性(npt2Ⅱ)基因而抑制卡那霉素是目前植物基因工程中被广泛应用了卡那霉素的作用,所以通过卡那霉素,转化体就很的选择标记。选择标记的功能是在选择压力下把容易从非转化体中筛选出来。转化体选择出来。为达到这一目的,首先要在选择培养基或选择溶液
5、中加入筛选剂,产生一种选择压2 卡那霉素在植物转基因中的应用力,使未转化细胞不能生长;其次是选择标记基因2.1卡那霉素在植物转化过程中的筛选作用的产物对筛选剂产生抗性使转化细胞不受筛选剂在植物的遗传转化过程中,由于转化体很少,所以必须进行筛选,卡那霉素作为一种筛选剂常常收稿日期:2002212226 修回日期:2003203210加入选择培养基中对转化体进行筛选。但卡那霉3863基金项目资助(101201201201)素毒性不能太高,因为当卡那霉素对未转化细胞有33通讯作者,电子信箱:yzlzj@public.cs.hn.gov强毒害时,细胞将快速死亡,死亡或将要
6、死亡的细©1995-2004TsinghuaTongfangOpticalDiscCo.,Ltd.Allrightsreserved.10中 国 生 物 工 程 杂 志第23卷胞对邻近的细胞将产生抑制作用,不利于转化细胞现象,可以分析外源基因的遗传特点。林良斌[3][11]生长。因为不同植物的不同外植体对卡那霉素等将转基因代(T0代)抗性种子在含卡那霉素的的敏感性不一样,所以筛选浓度也不一样,因此在培养基中萌发,后代(T1代)植株有性状分离现象,转化之前,应对卡那霉素设置一系列的浓度梯度,卡那霉素抗性株与敏感株的分离比约为3∶1,由此找出植物对卡那霉素的敏感性浓度
7、,以便在这个适说明外源基因是以单拷贝、杂合地整合到转基因植[12]当的条件下,非转化细胞的生长能有效地抑制,缓株的基因组中。相似地,商鸿生等将转基因线慢死亡。一般说来,单子叶植物对卡那霉素的敏感辣椒的T2代纯合系自交,得到T22T4代种子,同时程度较双子叶弱,因此在筛选过程中,单子叶植物将T2代植株与转化株杂交得F1、F2代种子,将这的筛选浓度要较双子叶高。比如说水稻,在遗传转些种子在含卡那霉素300mgPL的培养基上萌发,结化过程中卡那霉素对水稻愈伤组织的筛选浓度达果表明,抗卡那霉素标记基因在自交和杂交各代都到了500mgPL,由于卡那霉素毒性太高会对转化细能稳
8、定地高效表
