反转录实验步骤总结

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1、一．前期对一些重要试剂用量的评估（以mRNA100ng为计算标准）1.如果原材料0.2g（约5株2周苗期的苗），分成两管，每管0.1g，则分别加TRIzol2ml（共4ml），也就是说，每个生物样品作两次生物重复的话。每瓶TRIzol有100ml，所以可以做25个材料。2.一个材料作二次生物重复，需要4根ZymoRNA纯化柱。一个标准ZymoKit有100个反应柱子，也就是可以做25个材料。3.RNAfragmentation完整Kit可以做100个样品。4.mini/midiKit可以做12个柱子反应。二．前期准备工作1.DEPC处理的Rnasefree水；2.RNA专用的7

2、5%乙醇、异丙醇、三氯甲烷和NaOAc；3.220℃烘烤>6小时的研磨棒、器皿和药匙；4.足够的液氮；三．其它小知识理论上，每100mg材料可以获得100-200ugtotalRNA，纯化后获得的mRNA的量约为totalRNA量的1/100。四．具体实验步骤（一）TRIzol提取总RNA1．先将研磨棒等用液氮预冷，然后加液氮粉碎叶片（组织），越细越好。2．准备好TRIzol管，每50-100mg材料加入1mlTRIzol（材料体积应小于TRIzol体积的10%），振荡或用移液器打至无大颗粒（震荡2分钟可）。3．悬液室温放置>5min(可30min放置)。再加入1/5V（起始体

3、积）氯仿，剧烈振荡1-2分钟，室温放置5min。然后13000rpm2-8℃离心30min。4．吸取无色上清（约有1/2的起始体积量），加入1/2V（起始体积）异丙醇。室温放置10min。然后13000rpm2-8℃离心30min。5．弃上清液。沉淀物以75%乙醇洗涤（>1ml乙醇/1mlTRIzol）。然后13000rpm2-8℃离心10min。6．空转一次，吸去上清。7．适当干燥5min。加入经DEPC处理的Rnasefree水100ul，冰浴1小时。8．检测：2µl电泳检测，另取1µl稀释10倍后测OD值。9．【用RNasefree的Dnase酶切。（一般100ug的总R

4、NA中加4%-5%V的RNaseinhibitor和10-20U的Dnase，然后37℃30min）。】10．如果暂时不用，可以加1/10V的3MPH5.5的NaOAc和3V体积无水乙醇，-80℃放置2小时以上或overnight。然后12500rpm2-8℃离心154min，重复step5-7。（二）从总RNA提取mRNA（OligotexmRNAMidiKit）（REPEAT）(NOTE:Oligotex、OBB先37℃预热，然后振荡，25℃备用。OEB70℃预热。)1．根据以下表格依次混合在1.5ml微离心管内。须充分混合。totalRNAaddRnase-freewat

5、ertototalRNAsample:BufferOBB(µl)OligotexSuspension(µl)<=0.25mg250µl25015(miniKit)0.25-0.50mg500µl50030(midiKit)0.50-0.75mg500µl50045(midiKit)0.75-1.00mg500µl50055(midiKit)2．在70℃水浴3min。再室温放置20min。然后以14000-18000rpm离心2min，直至上清液澄清。（可将所弃上清液另外保留，第一遍提取结束后回收原先的Oligotex再次加10µl新的Oligotex，第二遍提取mRNA。）3．

6、沉淀用等体积的OBB和Rnase-freeWater充分振荡混合，再70℃水浴3min。再室温放置20min。然后以14000-18000rpm离心2min，直至上清液澄清。4．用400µl的BufferOW2充分振荡混合，转移至小离心柱放置于1.5ml微离心管内，以14000-18000rpm离心1min；重复此步骤。5．再以14000-18000rpm空转离心1min。6．将此小离心柱换入新的Rnase-free的1.5ml微离心管内。把70℃预热的BufferOEB75µl加入离心柱中，用移液器吹打3-4下后，即以14000-18000rpm离心1min进行洗脱。为了保证

7、能彻底的洗脱下来，重复此步骤，最后为150µl。（NOTE:多样品时，为保证洗脱效率，可将内置小离心柱的微离心管先置于70℃预热。）7．适量电泳检测。另取适量测OD值。（三）纯化mRNA（每柱量<25ug）（ZymoResearchRNAclean-upKit）1.每管mRNA样品中加4倍体积的RNA-BindingBuffer。混合后，转移至Zymo专用小离心柱放置于收集管内。以>10000rpm离心1min。2.然后加350µlWashBuffer至离心柱，以>10000rpm离心1mi