GB4789.29-94 食品卫生微生物学检验 椰毒假单胞菌酵米面亚种检验.pdf

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1、GB/T4789.29—1994中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验椰毒假单胞菌酵米面亚种检验MicrobiologicalexaminationoffoodhygieneExaminationofPseudomonascocovenenanssubsp.farinofermentansGB4789.29—19941主题内容与适用范围本标准规定了椰毒假单胞菌酵米面亚种检验的基本要求、操作程序和结果判定。本标准适用于酵米面、变质鲜银耳及其他淀粉发类发酵食品引起食物中毒的病因学诊断及椰毒假单胞菌酵米面亚种的常规检验及

2、菌种鉴定。2引用标准GB4789.28食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂GB11675银耳卫生标准3设备和仪器3．1超净工作台。3．2采样勺。3．3灭菌平皿：直径9cm，12cm。3．4灭菌试管、吸管。3．5灭菌三角瓶：100mL，500mL。3．6灭菌L形玻璃棒。3．7灭菌透明玻璃纸、滤纸。3．8小试管（血清凝集试验用）。3．9离心管。3．10玻璃漏斗。3．11接种针、接种环。3．12酒精灯。3．13玻片、染色缸。3．14显微镜（带油镜头）。3．15天平。3．16pH计。3．17恒温水浴锅。3．18恒温培养箱：

3、36±1℃、26±1℃。3．19电冰箱：4～20℃3．20离心机：4000r/min。4培养基和试剂4．1革兰氏染色液：按GB4789.28配制。4．2氧化酶试验：按GB4789.28执行。中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施.www.bzxzk.com.GB/T4789.29—19944．3马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）：按GB4789.28配制。4．4马铃薯葡萄糖半固体琼脂：按4.3PDA配方，不加琼脂。4．6GVC增菌液（椰毒假单胞菌酵米面亚种增菌用）：在高压灭菌的PD水（4.5）中，

4、以无菌手续加龙胆紫水溶液（最终浓度为1/10万），氯霉素水溶液（最终浓度为20ug/mL），混匀、分装后置4℃备用。4．7卵黄琼脂：按GB4789.28配制。4．8SS琼脂：按GB4789.28配制。4．9Hugh-Leifson培养基：（O/F试验用）：按GB4789.28配制。4．10蛋白胨水（靛基质试验用）：按GB4789.28配制。4．11缓冲葡萄糖蛋白胨水（MR和VP试验用）：按GB4789.28配制。4．12西蒙氏柠檬酸盐培养基：按GB4789.28配制。4．13苯丙氨酸培养基：按GB4789.28配制。4

5、．15兰固体琼脂：按GB4789.28配制。4．16抗O多价血清、型特异性因子血清（O-Ⅲ、O-Ⅳ、O-V、O-Ⅶ型、O-Ⅷ型）。5检验程序椰毒假单胞菌酵米面亚种检验程序如下：6操作步骤6．1增菌用无菌操作取样品25g，加入盛有225mL增菌液的500mL三角瓶中（鲜银耳样品取1g，用剪刀剪碎，加入盛有20mL增菌液的100mL三角瓶中）放36±1℃培养48h。6．2分离、纯化培养取增菌液1接种环，划线接种PDA平板，36±1℃培养24～48h。观察平板上生长菌落的形态，挑取可疑单个菌落，进行革兰氏染色及氧化酶试验。革

6、兰氏染色阴性，氧化酶试验阴性的菌落再点种卵黄琼脂平板及SS琼脂平板，36±1℃分别培养48h。椰毒假单胞菌酵米面亚种在不同分离平板上的菌落特征见表1。表1培养基菌落特征菌落1～2mm，灰白色或乳白色，光滑、湿润、边缘整齐。培养PDA平板48h后，中心有凸起，呈草帽状，菌落周围有黄绿色素扩散到基质中菌落表面光滑、湿润，48h，菌落周围形成乳白色混浊环，斜卵黄琼脂平板射日光下可见环的表面呈虹彩现象SS琼脂平板不生长从卵黄琼脂平板挑取卵磷脂酶阳性，并逞有虹彩环的单个菌落，接种PDA斜面36±1℃培养24h，供下步试验用。6．

7、3生化试验从纯培养的PDA斜面上挑取少量菌苔，分别接种Hugh-Leifson培养基、蛋白胨水、缓冲蛋白胨水、西蒙氏柠檬酸盐养基、糖发酵管及苯丙氨酸培养基，36±1℃培养，按单项试验的要求分别进行观察。椰毒假单胞菌酵米面亚种生理生中华人民共和国卫生部1994—03—18批准1994—09—01实施.www.bzxzk.com.GB/T4789.29—1994化性状见表2。表2阳性阴性动力尿素氧化酶O/F试验（O型）明胶液化靛基质葡萄糖卵磷脂酶V-P果糖侧金盏花醇MR木糖柠檬酸盐利用H2S产生半乳糖精氨酸5℃不生长阿拉伯

8、糖石蕊牛乳41℃不生长甘露醇37℃肌醇卫茅醇硝酸盐还原6．4血清学分型鉴定6．4．1O抗原的制备将马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）斜面36±1℃，24h培养物用灭菌生理盐水洗下，煮沸2h，再用灭菌生理盐水稀释至5～10亿/mL菌悬液，作为凝集试验用抗原。6．4．2O抗原的鉴定用多价血清做玻片凝集试验，同时用生理盐水做对照。与多价血清凝集