CRISPR-Cas-新一代基因编辑技术

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1、生命的化学,2015,35(1):113-118黄妤,等.CRISPR/Caswww.life.ac.cn：新一代基因编辑技术doi:10.13488/j.smhx.20150119·113·技术方法CRISPR/Cas：新一代基因编辑技术黄妤*，王世春(安捷伦科技（中国）有限公司)摘要：CRISPR/Cas技术是一项新兴的基因编辑技术，它利用与目标序列互补的向导RNA(sgRNA)引导Cas酶定点切割DNA。由于该技术操作简便、要求低，已成为近几年最受关注的基因编辑技术。而随着该技术的广泛使用和人们对CRISPR/Cas系统了解的不断深入，对该技术优

2、与劣的争论也不断升温。本文就该技术的起源、CRISPR/Cas系统的工作原理，以及目前的主流应用和成果进行了介绍，希望能够帮助人们对CRISPR/Cas技术有一个更全面的了解。关键词：CRISPR/Cas；基因编辑技术；向导RNA基因编辑技术是指对DNA目标序列进行插些间隔序列与噬菌体基因组序列存在100%的同源[2]入、删除或序列改变的操作方法。基因编辑技术性，这表明间隔序列来源于外源生物体基因组。的不断发展、创新和改良，推进了对基因生物学这些间隔序列在被转录成为crRNA(CRISPRRNA)功能的研究。在CRISPR/Cas出现之前，科学家只后，

3、能够和细菌自身的Cas核酸酶形成复合体，对能通过对庞大的突变体库进行筛选，或通过繁琐Cas核酸酶的靶向切割起到导向作用，当入侵的外耗时的同源重组等方式来对DNA进行编辑。CRIS-源DNA和这一段转录的crRNA序列一致时，Cas蛋[3]PR/Cas技术突破了基因编辑的瓶颈，为基因编辑白就能够对入侵的DNA进行靶向切割，从而达到提供了一把精确的手术刀和显微镜。科学家们利破坏外源DNA，实现自我防御的目的，因此这段用这一技术可对基因进行精确的定位切割，用来crRNA也被称为向导RNA(guideRNA或gRNA)。删除、插入、替换生物体内的目标基因，从而

4、实CRISPR最早于1987年被发现，但当时并未引现对基因功能的深入研究，或对大片段进行克起科学家们的重视。到了2005年，有三个研究小组[4-6]隆。发现，CRISPR可能与微生物的免疫作用有关。敏锐的科学家们开始认识到它的科研价值和商业1CRISPR/Cas——起源价值。借助crRNA对目标序列的特异性识别，引CRISPR/Cas技术的发现源自对细菌自身防御导Cas核酸酶准确定位目标基因并进行精确切割这系统的研究。CRISPR/Cas系统是细菌在抵抗病一特性，CRISPR/Cas成为科学家眼中理想的基因毒、噬菌体等外源DNA的过程中进化发展而来的编

5、辑工具。自我防御系统。科学家发现，当细菌受到病毒攻2CRISPR/Cas——作用机理击时，会作出以切割破坏外源DNA为目标的防御反应。在细菌和古细菌基因组中广泛存在一系列成以产脓链球菌(StreptococcuspyogenesSF370)的簇排列、高度保守的DNA重复序列，被称作“规II型CRISPR/Cas为例，来解析CRISPR/Cas在细菌体律间隔成簇短回文重复序列”(ClusteredRegularly内的工作原理(图1)。作为典型的CRISPR/Cas，InterspacedShortPalindromicRepeats,CRISPR)。重

6、II型CRISPR/Cas基因座结构包括5'端的tracrRNA复序列之间被间隔序列(spacer)隔开，间隔序列的(trans-activatingcrRNA)基因，tracrRNA主要是与长度与细菌的种类和CRISPR位点有关。这些间隔crRNA形成crRNA：tracrRNA复合体，帮助Cas9蛋[1]序列与噬菌体或质粒序列存在同源性，甚至有一白识别并与crRNA：tracrRNA复合体结合，实现特收稿日期：2014-11-12*通信作者：E-mail:louise.huang@agilent.com·114·《生命的化学》2015年35卷1期技

7、术方法上图显示了第一阶段：间隔序列的获得，第二阶段：crRNA的成熟过程，以及第三阶段：CRISPR/Cas对外源遗传物质的识别和切割。[7]图1　产脓链球菌CRISPR/Cas9基因座结构异性识别；中间是一系列Cas蛋白编码基因(包括的重复序列之间，即CRISPR5'端的两个重复序列Cas9、Cas1、Cas2和Csn2)，主要发挥核酸酶切割之间，从而获得高度可变的间隔区域；在第二阶作用；以及3'端的CRISPR基因座[由启动子区域、段，CRISPR基因座首先被转录成前体CRISPR大量间隔序列(spacers)和重复序列(directrepeats

8、)顺RNA，然后在Cas9和核酸酶的作用下被剪切成成序构成]，其中的前间区序列邻近基序(pro