阿特拉津高效降解菌及其降解酶粗酶液特性的研究

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1、中国农业科学院硕士学位论文阿特拉津高效降解菌及其降解酶粗酶液特性的研究姓名：应飞申请学位级别：硕士专业：农业昆虫与害虫防治指导教师：谢明20070601摘要阿特拉津是均三氮笨类内吸传导型除草帮，J’泛用于玉米、高粱、甘蔗、果园等防除一年生禾本科杂草及阔叶杂草，在农业生产中具有重要作用。阿特拉津在全世界火面积推广应用后，其对农珥及地下水酶污染、对压茬作耪的药襄、对人类潜在的遗传毒性笛融题日益突出。为了利用安全高教的生物降解技术控制和消除阿特拉洋在农田环境中的残留污染，本研究分离、筛选对阿特拉津具有赢效降解能力的菌株，研究了降解菌及其降解酶特性，为开发和应用酶制剂提供基础。本研究结果对控

2、制农田污染，促进粮食安全生产，保障人类身体健康，僳护生态环境均其有重要意义。具体研究结果如F：应用摇瓶酿l化珞莽方法，从滗北、山农等墙农药厂捧污[：：l淤泥中分离得到4株对§玎特拉津有降解能力的细菌；比较菌株对阿特拉津的降解效率，从中筛选fⅡ1株高效降解新菌株BZB一1。运用形态与生理生纯特征获发16SrDNA穿列分析等方法对菌株BZB一1送行鉴定。其形态及生理生化特征：革兰氏阴性菌，细胞呈长杆状，无芽孢，极生鞭毛，具有运动性，氧化酶阳性，接触酶雕性。该菌株为好氧、氧化型(菲发酵型)细港，能利用葡萄糖和乙醇，不能利用甲醇和乳酸，可以利用氨态氮和硝态氮优合物，NaCl的耐受浓度为0．5

3、～2％，生长漏度耐受范围为4q5℃。精氨酸脱羧酶阴性，晦氢酸脱羧酶阴性，赖氨酸脱羧酶阴性，枸橼酸盐阴性，硝酸盐还原阴性，尿酶阳性，七叶灵(蓊)水解酶羯性，蛋彝胨水(靛基质试验)阴性，o一硝基萃一B—D鸯E曛半乳糖苷酶(ONPG)阴性，蔗糖水解酶阳性，麦芽糖水解酶阳性，木糖水解酶阳性，葡萄糖水解酶

4、；日性，硫化氢阴性。BZB．1菌株的16SrDNA基闲序列与Shinellagranuli(颗粒申氏杆菌)的同源性达到99％，结合菌株的形态和生理生亿特性，综合判定该菌株为Shinellagranuli，此属种类在我国未见报道。研究明确了颗粒申氏杆菌ShinellagranuliBZB．1菌

5、株生长的基本规律和基本条件。颡粒申氏杆菌ShinellagranuliBZB．1菌株在牛肉膏蛋白胨培养基上生长时，o一6h处于延迟生跃期，6*20h对处于对数生长期，2011阻罱进入稳定及衰亡期；菌株BZB．1对温度的透癍范围较广，在4-～454C的条件下均能生长，最适生长温度为30Z：；菌株适宜的pH儆为6～9之间，最适pH为7；菌株生长对氧的需求量不赢，菌体有高浓度发酵生产的潜力。通过研究还明确了环境医予对BZB一1蘑株降解效率的影响。葙用气相色谱监测底物(阿特拉溶)变化量，5町特拉津底物浓度对降解率有显著影响，当阿特拉津浓度较低时(200mg／L)，菌株BZB一1在3天内即可将

6、其完全晦解(未检出，捡测聚为0．01ng／p1)，隧§玎转拉津浓度升高，其完全降解的时间也相应明显延长。接菌量对降解效率有显著影响，随着培养基中接种的菌体浓度的提高，阿特拉津的降解率也逐渐增加，在无机盐液体培养基中，当接菌浓度从2．56×106c／h／ml增赫到3．28×108cfulml时，其稆应的降解率从54．o％提高到99．7％。pH德对降解率有显著影嚷，当pH值为6—7时，菌株的降解效率较高(96．1—100％)，pH值大于7时或pH值小于6时，降解率明强降低(pH值为8对，降搬效率为54．O％；prt值为5丑寸，降解率为79．7％)，降解最适pH为7。温度对降解率的影响明嶷

7、，瀚株降解的最适温度为20—35。C，其降解率均大于98．3％，当温度小于20℃(88．8％)或高于35℃时(89．1％)．菌株的f锋解力玛开媲明显下降。为了明确菌株降解酶的利用价值，本文研究了降解酶粗酶液的基本特性。通过酶定位实验，明确了该菌株豹§时特拉津降解酶位子缓胞内，粗酶渡与阿特拉津(底物浓发50mgm，pH7。0，磷酸缓冲液体系3ml，温度30*(2)作用2h，其对底物的去除率可达到99．0％。结果表明，菌株BZB．1分泌的降解酶为组成型酶，在无底物诱导的牛肉膏蛋白胨培养基}：连续转接培养8代后，该菌对阿特拉津的降解能力仍保持在较高水平，底物诱导前后该菌对阿特拉律的降解能力

8、无显著变化。温度对粗酶液降解活性的影响明鼹，降解酶适宜的温度为25—35℃，35℃时粗酶液对阿特拉津的降解率为73．5％(酶与底物作用O，5h)，离漱会使酶瓣酶解活性骤然下降(40。C酶对底物的降解率为34．5％)。pH对粗酶液降解活性的影响明疆，当pH值为5～9．2，酶的活性随pH值的升高而上升，pH值为9．2时酶的活性最高(69．6％，酶与底物作用时间0．5h)。由此看来，该菌株产酶稳定(组成挚酶)，降解酶对溢度、pt-I的适应范羽较j、‘，对底物的降