实验三蛋白质的盐析分离和凝胶层析

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1、生物化学实验BiochemicalExperiment实验成绩评分方法实验预习情况（10%）实验操作情况（30%）实验报告情况（30%）实验考试成绩（20%）实验素质（遵守实验室规则和道德行为）（10%）本学期实验课安排9月11日生化实验常规仪器的使用4学时9月18日蛋白质的盐析分级分离及凝胶层析脱盐6学时9月25日醋酸纤维膜电泳鉴定蛋白质6学时10月9日蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝法和Fulin酚法）8学时10月16日蛋白质等电点的测定-等电聚焦8学时10月23日丹磺酰化分析蛋白质N-末端氨基酸I6学时10月30日丹磺酰化分析蛋白质N-末端氨基酸II6学时11月6日

2、猪肝DNA的制备6学时11月13日DNA定量和纯度测定6学时11月20日DNA变形和复性以及Tm值得测定6学时11月27日蔗糖酶的制备及各步比活力的测定8学时12月4日底物浓度对酶活性的影响及km值测定8学时12月11日正交法寻找蔗糖酶的最适反应条件8学时12月18日氨基转换反应的定性鉴定6学时12月25日LDH在不同组织中的表达分析-非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳10学时2007年1月综合设计实验（考试）6学时有关网址和参考书目http://www.bioon.com/molebio/biochem_books.htmhttp://www.kumc.edu/biochem

3、istry/bioc800/biocindx.htmhttp://cti.itc.virginia.edu/~cmg/http://www.bio-soft.net/赵永芳.生物化学技术原理及应用.北京.科学出版社.2002沈同王镜岩.生物化学.高等教育出版社.2002２、蛋白质的盐析分离和凝胶层析脱盐蛋白质的盐析分级分离SephadexG-25脱盐盐离子的跟踪检测ＵＶ检测蛋白质蛋白质提取、分离、纯化及鉴定技术材料（取材一定要新鲜，在低温下操作）破细胞（匀浆器，研钵，超声波，反复冻融，化学方法，酶解等）蛋白质提取（根据物质的性质，水、盐溶液、稀酸、稀碱、有机溶剂）蛋白

4、质分级分离（盐析分级分离、有机溶剂分级分离、等电点分离）进一步纯化（透析、柱层析：分子筛、离子交换、亲和层析、HPLC）鉴定（电泳：薄层电泳（纸，NC膜）、凝胶电泳（PAG，琼脂，淀粉）；结构分析；活性分析；呈色反应）含量测定（fonlin酚法、考马斯亮蓝G250法）蛋白质的分级分离（粗分级）一、盐析沉淀分离1、盐溶和盐析现象：低盐浓度下蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而增加；盐浓度升高到一定程度后，蛋白质的溶解度随盐浓度的增加而减小析出。2、盐的选择：通常采用中性盐，硫酸铵、硫酸镁、氯化钠、磷酸钠等。3、硫酸铵浓度的计算与调整：（1）加硫酸铵饱和液：V=V0（S2—S1

5、）/（1—S2）；（2）加固体硫酸铵：t=G（S2—S1）/（1—AS2）V为所加饱和硫酸铵体积；V0为原溶液体积；S2为需达到的硫酸铵饱和度；S1为原溶液硫酸铵饱和度；G和A为常数，0时G为507，A为0.27；20时，G为533，A为0.27。t为每升加入的克数。二、有机溶剂沉淀分离有机溶剂沉淀出的蛋白质沉淀比盐析沉淀出的蛋白质沉淀易于过滤或离心分离，分辨率好，但容易使蛋白质变性，通常在低温下进行。三、选择性沉淀法（等电点、热变性、酸碱变性等）四、吸附法五、重金属盐沉淀法蛋白质的进一步纯化（细分级）一、透析和超过滤二、层析（色谱）分离1、气相色谱（色谱仪）2、

6、液相色谱：纸层析和薄层层析（分配层析）、柱层析（分子排阻、离子交换、亲和层析、吸附层析等）3、高效液相色谱（色谱仪）两位英国科学家Martin和Synge发明了分配色谱（层析），他们获得了1952年的诺贝尔化学奖。一些常用的蛋白质纯化中的仪器机械细胞破碎仪超声波细胞破碎仪色谱工作站WINDOWS98作为色谱分析的数据采集和处理，后端采用数据库工具MS-SQL在网络上进行分析结果的存档、检索及打印等。高效液相色谱仪气相色谱仪蛋白质的盐析分离原理用大量中性盐使蛋白质从溶液中析出的过程称为蛋白质的盐析作用。蛋白质是亲水胶体，在高浓度的中性盐影响下脱去水化层，同时，蛋白质分子

7、所带的电荷被中和，结果蛋白质的胶体稳定性遭到破坏而沉淀析出。经透析或用水稀释时又可溶解，故蛋白质的盐析作用是可逆过程。分子量大的蛋白质（如球蛋白）比分子量小的（如白蛋白）易于析出。改变盐浓度，使不同分子量的蛋白质分别析出。凝胶层析原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。分子越小，进入凝胶内部越