家蚕Atg8蛋白乙酰化修饰对细胞自噬及凋亡的调控机制研究

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1、ZSTUZhejiangSci-TechUniversity硕士学位论文Master’sThesis中文论文题目:家蚕Atg8蛋白乙酰化修饰对细胞自噬及凋亡的调控机制研究英文论文题目:StudiesontheregulationmechanismofsilkwormAtg8acetylationmodificationincellautophagyandapoptosis学科专业：生物学作者姓名：薛圣杰指导教师：于威教授完成日期：2018年4月19日￣浙江理工大学学位论文原创性声明，崇尚严谨学风

2、，本人郑重声明：我恪守学术道德。所呈交的学位论文是本人在，独立进行研宄工作所取得的成果导师的指导下。除文中己明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本，人亲自撰写我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：曰期：汉年Ｚ月曰浙江理工大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解浙江理工大学有权保留并向国家有关部门或机构送交本。论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅本人授权浙江理工大

3、学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印成扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名曰期＂Ｅ指导教师签名：ｊ曰期：年＜月曰＂本研究由国家高技术研究发展计划“863”项目（No.2011AA100603）浙江省自然基金项目(LY17C170006）提供资助浙江理工大学硕士学位论文家蚕Atg8蛋白乙酰化修饰对细胞自噬及凋亡的调控机制研究摘要自噬（Autophagy）是真核生物中用于物质周转

4、的一个高度保守的过程，以应答外界胁迫条件，保障生命体生存。在该过程中，一些需要被降解的蛋白或细胞器会被具有双层膜结构的自噬小体包裹并运输至溶酶体。这一过程需要许多自噬相关蛋白（Autophagy-relatedprotein,Atg）的参与。Atg8蛋白（Autophagy-related8protein）作为两种泛素样蛋白之一参与了细胞自噬过程，它可与脂质磷脂酰乙醇胺（Phosphatidylathanolamine,PE）结合，随后转移至自噬膜上，并且Atg8的蛋白修饰会影响其行为，这些分子机制在哺

5、乳动物中已经被研究地较为透彻，但其在昆虫细胞中的自噬调控机制报道很少，尤其是蛋白的翻译后修饰的调控作用。家蚕作为鳞翅目的模式生物，其完全变态发育的过程受到营养及蜕皮激素等因子影响，而这些因子又能参与自噬的调控，因此，深入研究家蚕Atg8蛋白对细胞自噬及凋亡的调控机制具有重要意义。我们前期的家蚕蛋白乙酰化修饰组学分析结果显示，Atg8的K13位点可发生乙酰化修饰，由于蛋白的乙酰化修饰是对蛋白功能起调控作用的最主要翻译后修饰之一，在生命体中具有十分重要的作用，因此，在本研究中，为了深入了解家蚕Atg8蛋白乙

6、酰化修饰对细胞自噬过程和细胞凋亡的分子调控机制，我们利用原核表达系统大量表达了家蚕Atg8蛋白并制备了多克隆抗体，并利用定点突变技术深入研究了该蛋白乙酰化修饰对细胞自噬和细胞凋亡调控的分子机制。首先，提取家蚕细胞总RNA，利用RT-PCR技术克隆了atg8基因，构建原核表达载体pET28a-atg8，诱导表达目的蛋白并进行纯化，免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体。然后利用EBSS（Earle'sBalancedSaltSolution）刺激家蚕BmN细胞以建立细胞的自噬模型，研究饥饿时间对家蚕Atg8蛋白表

7、达水平的影响。结果显示：细胞自噬在诱导后极短时间内即可发生，并且Atg8-PE/Atg8的比例在饥饿2-4h后达到顶峰。然后利用重叠PCR技术分别构建了模拟乙酰化和去乙酰化的突变体，并插入瞬时表达载体pIEX-1中，转染家蚕BmN细胞进行过表达，Westernblot检测结果显示：Atg8乙酰化修饰抑制了细胞自噬的发生。进一步利用荧光蛋白mCherry作为标记，以pIEX-1作为载体，在家蚕细胞中进行融合表达，观察Atg8发生修饰前后细胞自噬的水平差异，结果显示：Atg8乙酰化后的细胞自噬水平较低，而去

8、乙酰化的Atg8自噬水平升高。最后，利用DNA片段化检测试剂和细胞流式细胞术分析家蚕Atg8蛋白乙酰化修饰对细胞凋亡的影响，结果显示：发生了乙酰化修饰的Atg8蛋白，其所在的细胞凋亡比率更高。I浙江理工大学硕士学位论文家蚕Atg8蛋白乙酰化修饰对细胞自噬及凋亡的调控机制研究综上所述可知，家蚕自噬相关蛋白Atg8的K13乙酰化修饰对细胞自噬的发生具有抑制作用，并且去乙酰化会一定程度的抑制细胞凋亡的发生。本结果将为深入研究家蚕细胞自噬调控的分子