E-钙黏素和β-连环蛋白在小鼠角膜上皮损伤修复中的表达变化和黏附增殖作用

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1、复旦大学硕士学位论文缩略词表缩略词表英文缩写英文全称中文全称AbAntibody抗体BSABovineselllmalbumin牛血清白蛋白CKCytokeratin细胞角蛋白Cx43Connexin43细胞缝隙连接蛋白43DEPCDiethylpyrocarbonate焦碳酸二乙酯DMEMDulbecco’SmodifiedEagle’smediumDulbecco改进的Eagle培养基DTTDithiothreitol二硫苏糖醇EDTAEthylenediaminetetra—aeticacid乙二胺四乙酸FACSFluorescence-ac

2、tivatedcellsorter流式细胞计数仪FBSFetalbovineSelalm胎牛血清FITCFluoresceinisothiocyanate异硫酸酯荧光素HEHemotoxylinandeosinstaining苏木精．伊红染色ODOpticaldensity光密度PBSPhosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应rpmRevolutionsperminute转，分钟Real-timeFQ—PCRReal—timefluorescentquantita

3、tivePCR实时荧光定量聚合酶链式反应RT．PCRReversetranscriptase—polymerasechain逆转录多聚酶链式反应reactionSDSSodiumdecdecylsulfate十二烷基硫酸钠SEMScanningElectronmicroscope扫描电镜TeMTransmissionElectronmicroscope透射电镜UIJnit酶活单位论文独创性声明本论文是我个人在导帅指导下进行的研究]．作及取得的研究成果。论文中除了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同志对

4、本研究的肩发和所做的负献均已在论文t4·作了明确的声明并表示了谢意。作背签名蔓鱼盛论文使用授权声明日{}1]：趣2：』：』本人完全了解复旦人学自‘关保留、使JfJ学位论文的规定，H口：学校有权保留送交论文的复印件，允n+论文被查阅禾J借阅：学校口J‘以公布论文的全部或部分内容，·，】_以采朋1影印、缩印或其它复制手段保存沦文。保密的论文在解密后遵守此觇定。⋯名：掣剐鼢醛慨—型复旦大学硕士学位论文摘要目的通过角膜上皮刮除，建立角膜损伤模型，探讨E-cadherin和13-catenin在小鼠角膜创伤愈合过程中的表达变化和对创伤愈合的作用，并对两者之间

5、的相互作用及与此可能相关的信号转导通路做初步研究。方法选择6—8周的C57BL／6J小鼠，通过刮除角膜上皮，制作角膜损伤模型。将角膜损伤后的小鼠根据时间随机分成7组，分别为损伤后3h、6h、9h、12h、18h、24h和48h组。对角膜进行荧光素染色，在裂隙灯下观察、照相，并用LeicaQWin软件计算角膜损伤面积。光、电镜下观察角膜组织结构。AE5免疫荧光染色，并结合流式细胞术，对角膜上皮刮伤修复过程中的细胞进行系统的观察与分析。用RT—PCR和免疫荧光染色检测正常小鼠角膜组织中E—cadherin和13-catenin的表达。通过Real．ti

6、mePCR和WesternBlot方法检测损伤后不同时间点E—cadherin和p-catenin的mRNA、全蛋白和胞浆蛋白表达变化情况。采用免疫荧光染色法检测p-catenin和磷酸化13-catenin(Ser33／37／Thr41)分布特点。Real-timePCR检测Cx43的表达变化，RT-PCR检测PCNA及CyclinDl的mRNA表达情况。结果荧光素染色、HE和电镜显示角膜上皮刮除后6h，细胞开始迁移，创口损伤面积开始显著减小，到24h创口基本再上皮化，48h上皮形态和连接结构恢复到正常。AE5荧光染色显示覆盖创口区域的细胞均呈阳

7、性免疫反应。流式细胞术可见凋亡率在6h达到最高值，以后凋亡率逐渐下降，至损伤后24h基本趋于正常。细胞周期分析示s期细胞在9h开始增多，至24h达到顶峰，观察的24h内只发生一次增殖。E-cadherin和13-cateninmRNA在正常小鼠角膜中有表达。免疫荧光染色显示E-cadhedn主要表达在角膜上皮细胞胞膜，13-catenin在角膜的上皮、基质和内皮层均有表达。Real—timePCR显示，损伤后3hE-cadhedn和13-catenin表达均升高，并达最高，之后持续下降。WesternBlot显示，E．．cadherin蛋白在损伤后

8、3h～18h均比正常低，至24h表达开始增多，48h蛋白表达明显增多。13-catenin全蛋白在损伤后3h到12h表达没