《疫组化显色系统》PPT课件

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1、免疫组化显色系统VisualizationSystemsofImmunohistochemistry(IHC)免疫组化技术原理用标记物或显色物标记抗体或抗原通过免疫学中的抗原与已知抗体反应来检测组织或细胞内的抗原成分免疫组化染色是一项综合性技术组织材料的准备免疫组化染色前处理免疫组化染色(一抗,显色系统)免疫组化原理图标注解一抗1一抗2抗兔二抗抗鼠二抗组织抗原1抗原2过氧化物酶碱性磷酸酶双染阻断剂显色剂(棕色)显色剂(红色)葡聚糖骨架分子回顾过去直接法二步间接法三步间接法酶免疫复合物法链亲和素-生物素法(ABC)目前常用的显色系统一步法:EPOS(EnhancedPoly

2、merOne-StepStaining)二步法:EnVisionSystems双染:GeneralDoublestain三步法:LSAB(LabeledSstreptavidin-biotin)催化放大系统:CSA(CatalyzedSignalAmplicationSystem)动物研究试剂盒:ARK(AnimalResearchKit)一步法EPOS原理:在一抗上通过多聚骨架标记过氧化物酶.即一抗上已标记过氧化物酶.这种一抗与抗原结合后即可直接显色.多聚骨架分子特异性一抗组织抗原过氧化物酶一步法EPOS主要实验流程组织片脱蜡,水化阻断(S2001)TBS冲洗(S196

3、8)一抗/HRP(U…)TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)水漂洗素木精复染(S3309)一步法EPOS特点:一抗孵育后直接显色即用型试剂快速(一步)完成敏感性较差昂贵使用对象:要求快速出结果的免疫组化实验对象二步法EnVision原理:在葡聚糖大分子上标记二抗及酶,将传统的二抗和三抗(酶)连接在一起,形成一个复合物EnVision.两步孵育完成免疫组化.二步法EnVision原理图一抗与抗原结合EnVision二抗复合物与一抗结合二步法EnVision主要实验流程阻断内过氧化酶(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.

4、)EnVision(Mo.K4001Rb.K4003)TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)苏木精复染(S3309)TBS冲洗(S1968)二步法EnVision特点:二抗及酶通过葡聚糖连成一个大分子试剂(避开了传统的生物素与链亲和素结合),不受内源性生物素干扰.即用,方便,快速(两步).敏感性强.背景低.是目前最理想的免疫组化显色系统使用对象可向所有做免疫组化的用户推荐.EnVision二步法双染原理:与EnVision二步法原理相同,只是为达到在同一组织上标记两种抗原.必需用两种动物来源的一抗(常用抗小鼠和兔),分别配相应的EnVisi

5、on(二抗),再用两种颜色的显色剂显色.EnVision二步法双染原理图鼠一抗接抗原1鼠EnV/HRP接抗鼠一抗DAB(显色剂1)双染阻断剂兔一抗接抗原2兔EnV/AP接抗兔一抗FastRed(显色剂2)EnVision二步法双染主要实验流程阻断内过氧化酶(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗(1Mo.)孵育TBS冲洗(S1968)EnVision/HRP(1Mo.)TBS冲洗(S1968)显色剂1DAB(K3467)蒸馏水冲洗双染阻断剂(Kit含)一抗(2Rb.)孵育TBS冲洗(S1968)EnVision/AP(2Rb.)TBS冲洗(S1968)显色剂2FastR

6、ead(K0597)蒸馏水冲洗苏木精复染(S3309)EnVision二步法双染特点:即用,方便,快速,省时.敏感性强.背景低.在同一组织切片上,用两种不同标记物标记两种不同的抗原.使用对象需在同一张切片上标记两种抗原者主要是形态学科研人员三步法LSAB(LabeledStreptavidin-biotin)原理:应用生物素标记二抗与过氧化物酶或碱性磷酸酶标记链亲和素(Streptavidin)的亲和作用,连接一抗及抗原,形成大分子.再通过相应酶的底物(显色剂)作用使之显色.三步法LSAB(LabeledStreptavidin-biotin)原理图:一抗与抗原结合二抗/

7、Bio与一抗结合STPA/HRP(AP)与二抗/Bio结合三步法LSAB(LabeledStreptavidin-biotin)主要实验流程阻断内过氧(S2001)TBS冲洗(S1968)一抗孵育(Mo.Rb.)TBS冲洗(S1968)TBS冲洗(S1968)二抗/生物素(Mo.E354Rb.E353)TBS冲洗(S1968)显色剂DAB或AEC(K3467或K0697)FastRead(K0597或K0699)苏木精复染(S3309)链亲和素/HRP或AP蒸馏水冲洗三步法LSAB(LabeledStreptavidin-bi