抗鹅细小病毒VP1蛋白单克隆抗体的制备及其识别抗原表位的初步鉴定

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1、摘要摘要鹅细小病毒(Gooseparvovirus，GPV)属于细小病毒科(parvovirinae)依赖病毒属(Dependovirus)，是鹅纲小病毒瘸(Gooseparvovirus)酶病原体。鹅细小病毒病又称小鹅瘟(GoslingplagueGP)，其主要侵害30日龄以内的各种雏鹅和雏番鸭，是一种急性、高度接触性、败血性传染病。该瘸具有传染性强、瘸死率高的特点，以目前仍是危害养鹅业发展的最主的要传染病之一。由予本病长期困扰着养鹅监，因此建立一种准确、简便的诊鞭方法懿对该瘸作出早期的诊断已成为迫切的需要。细小病毒具有基因组短小，衣壳结构简单的特点，所以它{

2、’】的无关抗原成分更易于筛除，

3、并利于将其制造成亚单位疫苗和重组诊断抗原。鹅细小病毒VPI蛋白(GPuVPl)是鹅细小病毒的主要结构蛋白，它在病毒感染细胞的过程中起着重要的作用，通过单克隆抗体技术对GPV．VPl的抗原表位进行研究，不仅有助于了解其抗原结构与功麓的关系，琵显对该瘸的诊断以及设计安全有效的基因工程袭位疫苗等具有重要的意义。本研究首先构建了带有表达载体pET30a(+)的重组GPV-VPl，在大肠杆菌原核表达系统中避行了表达，裁用GPV感染鹅的盘清对表达产豹进行Westernblot分橱，证实表达的融合蛋囱具有较好的反应活性。然后以纯化后的GPV-VPl融合蛋白为免疫抗原，免疫BALB，c小鼠，并以其作为为筛选抗

4、原，建悫检测抗GPV-VPl蛋白单克隆抗体的ELISA方法。按常规方法进行敲合，间接ELISA方法进行筛选，采焉有限稀释法，经过三次竞隆，最终共获得了5株针对VPl蛋白的杂交瘤细胞系(命名为3A8、3G4、481l、5G6、5C11)，平均染色体数为9l圭7对，分泌的单巍隆抗体亚型分别为19A、IgGl、IgG2b、IgGl、lgGl型，轻链均为1c链。用5株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体分别与纯化后的重组融合蛋白GPV-VPl进行Westernblot试验，在GPV-VPl蛋良处均出现明显的特异性条带，说明这5株单抗识别的抗原表位为线性抗原表位。为了进一步分析这5株单抗的抗原表位，用本实验室制备

5、的GPV-VPl截短表达的19个重组鬣自，分舅

6、l进行Westemblot的鉴定，结栗显示有3株单抗麓够特异性识别VP(81．136)，1株单抗能够特异性识别VP(124．161)，另一株既能识别VP(81．136)又能识别VP(124。161)。利用覆盖VP(81．161)氮基酸序列进一步截短表达的重组蛋白对这5株肇抗再次进行鉴定，根据结果初步确定了5株单抗抗原表位的主要功能区域。本研究制备了针对GPV结构蛋白的单抗，并初步对其相应抗原表位区域进行了鉴定，对进一步了解GPV的分子抗原特性，建立基于抗原表位水平的特异性诊断方法以及设计新型的GPV亚单位疫苗等其有重要意义。关键词：鹅细小病毒；V

7、Pl蛋白；单克隆抗体；抗原表位东北农业大学农学硕：仁学位论文ofthereactedproteinstodetectthesefiveMcAbs．ThenwedefinitedthemaindomainsoftheepitopesIthesefiveMcAbs．TheoverlappingregionVPI(81—161)werethendividedintofagments．OnthebasisdfttWesternblotresultswithmulticlonalantibodyserumoncewehaddone．couldalSOshowtheseantigcepitopeshadb

8、etterdominantpositionwhenitWasinfectedbyGPV．ThisstudyhaspreparedMcABsagainstproteinGPV-1旧1，anddetectedtheepitopesofthem．Itcanhe：UStobettercomprehendthecharacteristicsofitsantigen，andhasasignificantmeaningfordiagnosingardesigningthesafeandeffectivegeneticengineeringepitidevaccineagainstGPVonthebasiso

9、fthemoleculevelofepitopes．Keywords：GPV；VPl；MAbs；epitopesCandidate：LiLiSpeciality：PreventiveVeterinaryMedicineSupervisor：Prof．WangJunwei独创声，明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，