胃癌相关基因的克隆与鉴定

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1、中国医科大学博士学位论文胃癌相关基因的克隆与鉴定姓名：任群申请学位级别：博士专业：细胞生物学指导教师：张学2003.4.1胃癌相关基因的克隆与鉴定中文摘要前言肿瘤是一类常见的严重危害人类健康的体细胞遗传病，其发生率和死亡率均呈逐年上升的趋势，恶性肿瘤已成为人类致死的最主要的原因之一。目前研究的结果表明肿瘤是细胞中多种基因突变积累的结果，这些基因突变主要发生在3类基因，即癌基因(oncogene)，肿瘤抑制基因(tunlorsup．pressorgene)，DNA错配修复基因(DNAmismatchrepairgene)。其中绝大多数肿瘤的基因都是体细胞变

2、异，包括突变，扩增，重排，缺失或甲基化状态的改变。肿瘤的发生是一个多基因参与的，多阶段的复杂过程。癌基因，肿瘤抑制基因的发现促进了对细胞周期及细胞凋亡机制的深入理解。使人们对肿瘤发生和发展的认识也日趋深入。探讨不同类型肿瘤相关基因是认识肿瘤发生分子机理，开展基因诊断和基因治疗的基本前提。90年代初期，针对癌基因和肿瘤抑制基因研究中出现的问题，特别是单个基因分析的局限性，提出了人类基因组研究，尤其是癌基因组解剖计划(CancerGenomeAnato。myProect，CCAP)的全面启动，力求从根本上阐明肿瘤发生的分子机制，并提出有效的干预和治疗措施。我

3、国根据自己的具体国情，需求和优势，紧紧围绕基因组计划，积极开展肿瘤相关基因的克隆，定位工作。胃癌在我国是造成死亡人数最多的恶性肿瘤，每年死于胃癌的人数约16万人，近年来其发病率有上升趋势，严重地威胁着广大人民的健康。阐明胃癌发生和发展的分子机理进而指导肿瘤防治，在我国有特殊的重要性和迫切性。同其他恶性肿瘤一样，胃癌的发生也是由多因素参与，并经历了多阶段的演变过程，涉及到多种癌基因的激活和肿瘤抑制基因的失活。通过研究使我们认识到，胃癌发生发展的关键是正常细胞的基因组发生了改变，自发性、化学物理性，以及病毒性致癌因素只是诱因，而基因改变才是导致细胞生长发育的

4、正负调控和功能紊乱的分子基础。因此，开展胃癌相关基因的克隆和鉴定工作，是我国围绕基因组计划开展的一项重要具体工作，具有重要的意义。本文采用染色体杂合性丢失研究(10ssofheterozygosity，LOH)、筛查胃癌相关单个基因的突变以及抑制性消减杂交(suppressedsubtraetivehybriza．dtion，SSH)的方法发现并鉴定胃癌的相关基因，将为胃癌的深入研究打下基础。材料和方法胃癌标本来源于中国医科大学附属第一临床学院肿瘤科患者，手术切取胃癌组织及距癌组织1厘米以上的癌旁正常组织。手术切取胃癌组织及癌旁正常组织均经病理证实。1．

5、18号染色体的杂合性丢失分析选择18号染色体的9对短插入／缺失多态(ShortInsertionDeletionP01．ymorphism，SIDP)标记，以激光捕获显微切割(LaserCaptureMeerodissection，LCM)一高可信度全基因组扩增(highfidelity—wholegenomeamplification，HF—wGA)一变性高效液相色谱(DenaturingHighPerformanceLiquidChro-matography，DHPLC)联合技术进行LOH的分析，与癌旁正常组织相比，癌组织DNA的PCR扩增产物的DH

6、PLC色谱蜂数目减少或色谱峰相对高度减少50％以上判定为LOH，所有阳性病例应用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳加硝酸银染色证实。2．KLF6基因的突变分析联合应用PCR和DHPLC技术对35例胃癌患者组织进行ⅪJ唔基因编码区全部外显子序列突变筛查。与正常组织的色谱峰型进行比较，在部分变性温度条件下，相应肿瘤组织色谱蜂的个数和蜂的对称性改变，如出现肩峰及不对称峰，说明有变异发生。将此PCR产物纯化后测序，然后与基因库序列比较确定变异性质。3．BRAF基因v599E位点突变分析采用传统的限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpoly

7、mor-·2·phism，RFLP)标记分析方法，即运用两次PcR反应得到大量纯化的包禽有BRAF基因第1796位核营酸鹃产镌，耀Taal限裁彀核酸凑切酶隳甥震，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行片段分离。对经酶切后能产生59hp酶切片段的第二轮PCR产物用TaKaRa公司的PCR产物缝亿试荆盒透褥缝纯磁送TaKaRa公司测序确定突变。4．抑铽清减杂交方法筛查青年入髯癌褶关萎医采用TRIzol试剂分别提取青年人胃癌及癌旁正常组织的总RNA，用CLONTECH公溺SMA髓“羚ReDNASynthesisKit分别会成青年久霉癌及痰旁正常组织的双链eDNA，用CLO

8、NTECH公司CLONTECHPCR～Selectl”eDNASubtracti