MethodsinMammalianAutophagyResearch哺乳动物自噬研究方法

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1、哺乳动物自噬研究方法自噬和许多生理和病理过程相关。因此，有一个持续增长的科学需要来精确的鉴定、量化并对自噬进行操作。然而，自噬包含许多动态的复杂的过程，它经常被错误的分析。在这篇读物中，我们通过主要关注哺乳动物的大自噬来讨论观察自噬和调控自噬活性的方法。简介过去的十年见证了一种叫做自噬的基本的细胞生物学途径的研究的爆发。自噬需要的进化上保守的基因的发现使得科学家们能够发现自噬的稳态、发育和其他生理功能。不仅如此，越来越多的证据表明自噬的反常可以导致一系列的哺乳动物疾病。因此，对于科学家来说有一个急剧增长的需要去精确的探究自噬并且研究其在不同生物学事件中的作用，尤其是在哺乳动物体系中

2、。哺乳动物自噬的研究被历史上两个主要的问题所困扰。第一，用静态的分析来捕获动态的过程是有难度的，基于这些分析手段进行推断是有内在的限制的。第二，区分形态和功能并且避免陷入基于给定的生理学设定的检测来赋予自噬生理学功能的陷阱。这两个挑战似乎成了我们错误的理解哺乳动物自噬功能的源泉。比如，特定的神经和肌肉退行性疾病起初被认为至少部分和增多的自噬（基于显微镜对于通路中增多的中间体的观察）是相关的，然而事实上，在这些疾病中早起中间体的积累可能会阻断其晚期的自噬过程。自噬，一个临死细胞正常的形态学特征，常被错误的认为是细胞死亡的途径，然而现在看来其主要的功能之一是在“威胁生命”的环境下来维持

3、细胞的生存。这些哺乳动物自噬研究的历史性的挑战在阐明自噬的分子机制时通过利用先进的自噬研究的新方法被部分克服了。因此，在过去的十年，大量的新方法被用来观察自噬的动态过程以及为了在特定的细胞过程中研究自噬的功能来调节它。这篇文章是为了现在自噬研究可用的技术以及在解释中存在的限制提供一个综述。每一种方法的更加详细的信息可以在其他综述中找到。自噬的基础知识自噬是细胞质中物质包括细胞器到达溶酶体被降解的一些过程的总称。在自噬的三种类型（大自噬，小自噬和蛋白伴侣介导的自噬）中，研究的最深入的是大自噬。蛋白伴侣介导的自噬包含了胞质蛋白定向转运到溶酶体膜的过程，这一过程需要蛋白伴侣来进行解折叠。

4、小自噬是溶酶体膜的内陷，这样使得一小部分胞质进入溶酶体腔。大自噬将是这篇文章中主要关注的途径。这条途径从酵母到哺乳动物都很保守，并且被一个术语叫做自噬体的特殊的细胞器所介导。在诱导作用下，一个被称为隔离膜或者自噬泡的小囊泡逐渐延伸随后包裹了一部分细胞质，最后形成了双层膜的结构——自噬体。然后，自噬体的外膜和溶酶体融合（形成自溶酶体），导致自噬体内膜和其所包被的物质的降解。在和溶酶体融合之前，自噬体也可以和核内体融合形成自噬内涵体。自噬体的降解产生了一些氨基酸或者其他小分子用于循环或者产生能量。下面描述的方法探究了自噬途径的不同时期（比如，早期自噬体，自溶酶体，自噬降解产物），这些方

5、法应该被协调的使用来判断途径中中间产物的增多是否代表了自噬降解的增多或者是否代表了自噬途径完成的阻断。在生理环境下，自噬有一系列重要的作用比如在饥饿时维持氨基酸库，胚胎植入前发育，抑制神经退行性疾病，抗衰老，抑制肿瘤，胞内微生物的清除以及天然和适应性免疫的调控。自噬的特征之一就是它的动态调控性，在基础条件下，细胞中自噬活性是很弱的，但是可以通过大量的刺激来显著上调其活性。自噬的最广为人所知的诱导剂就是营养饥饿，无论是在从酵母到哺乳动物的培养细胞中还是在完整的生物体中。除了饥饿，自噬也可以被一些其他的生理压力刺激（比如缺氧，能量消耗，内质网压力，高温，高密度环境），激素刺激，药剂（比

6、如雷帕霉素和下面讨论的其他复合物），内部免疫信号，一些疾病诸如细菌性的、病毒性的、寄生感染、急性胰腺炎、心脏病，蛋白aggregopathies所激活。相反的，自噬的抑制常常和一些特定的疾病相关，包括一系列的癌症，神经退行性失调，感染性疾病，炎症性肠病，并且自噬功能的减弱是衰老的普遍特征。考虑到自噬和不同的生理学以及病理生理学过程的重要相关性。在自噬研究方面有一个对于科学方法持续增长的需要来在一个给定的生物事件中准确判断自噬是否存在，上调或者抑制以及基本的自噬和/或修饰的自噬是否（以及如何）和在研究的生理或者病理生理的一些过程相关。自噬的执行和一系列进化上保守的基因产物相关，被称为

7、Atg蛋白，这些蛋白对于隔离膜和自噬体的形成是必需的。自噬体形成的过程包含两个重要的步骤，成核和隔离膜的延伸。ULK/Atg1激酶复合体，自噬特异的磷脂酰肌醇3-激酶复合体，磷脂酰肌醇三磷酸效应物以及和他们相关的蛋白对于成核的步骤是重要的，Atg12和LC3/Atg8接合系统对于延伸的步骤是重要的。此外，在自噬中还有其他的蛋白对于自噬体溶酶体融合，溶酶体酸化溶酶体消化，整合环境线索的调节信号是必需的。自噬的详细的分子调节和机制在其他地方阐述过。在哺乳动物细胞中，大多数