玉米苗期耐渍QTL的遗传定位

《玉米苗期耐渍QTL的遗传定位》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

分类号：华中农业大学博士学位论文密级：玉米苗期耐渍QTL的遗传定位GeneticMappingofQTLAboutWaterloggingToleranceinMaizeSeedings(ZeaMaysL．)研究生指导教师指导小组：专业：遗传学学位级别：理学博士张小波郑用琏教授邱法展副教授郑用琏教授邱法展副教授严建兵教授张祖新教授岳兵副教授研究方向：玉米遗传学获得学位时间：2012年06月华中农业大学生命科学与技术学院二。一二年五月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书学位论文雹如需保密，解密时间年月日是否保密独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究王作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特嬲加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其纯人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含荛获得华中农业大学或其他教育机扮的学位或证书面使用过的材料，指导教师对此进行了审定．与我一阋工作的同志对本研究所敛的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。研究生始弛．J、茂帆沙附岁月f≯日学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关子保存、使用学位论文的规定，印学生必须按照学校要求提交学位论文的印劂本和电子版本；学校有权保存提交论文的印剽舨和电子版，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、编印或翔描等复制手段保存、汇编学位论文．本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换瑕务，蕊对本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文(印涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文)在解密后适用于本授权书．榭嫦槲咏州岐翮虢聊舯L签名疆麴：如lp每y月l中疆签名日期：工玲f2／年r冀f乒窭 华中农业大学2012届博士研究生学位论文目录中文摘要⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯IAbstract．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．III缩略表⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．IV1．前言⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．11．1渍害对玉米生产的影响及研究渍害的重要性⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．2作物渍害研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．2．1渍水对玉米形态、细胞学水平的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．11．2．2渍水对玉米生理生化的影响⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一11．2．3玉米受渍水胁迫诱导的基因表达研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．21．2．4玉米耐渍基因的遗传定位研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．31．2．5水稻耐渍性状的研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一31．2．6大、小麦和豆类的耐渍研究⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．2．7拟南芥耐渍性状的研究进展⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．51．3植物复杂性状的遗传解析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一61．3．1遗传标记⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．71．3．2分析方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯101．4研究目的与意义⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯162．材料方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．1材料⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯172．2方法⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．182．2．1盆栽的方法及表型考查⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯182．2．2基因型鉴定⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯192．2．3统计分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯2l3．结果：⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1群体构成和特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1．196份自交系群体群体构成和特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯223．1．2144份自交系群体群体构成和特点⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．23 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位3．2表型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．2．196份自交系群体表型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯283．2．2144份自交系群体的表型分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．333．3定位分析⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．3．1候选基因关联分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯383．3．2全基因组关联分析结果⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯403．3．3连锁作图及与关联作图的比对⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯473．4候选基因预测⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯5l4．讨论⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．524．1玉米苗期衡量渍水影响的性状⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯524．2主效QTL的全基因组关联作图和连锁作图验证⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．544．3次级综合性状定位的QTL⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯554．4LD和群体结构⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．564．5候选基因⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯574．6阈值的选择⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯584．7创新点和不足⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯595．参考文献⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯61附录lEcoTILLINGPCRcomponent⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯74附录2EcoTILLINGPCRprocedure⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯一74附录371SSRsinformation⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．75附录496inbreds⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．76附录5144inbreds⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯77附录6关联位点(p<2．18x10’4)⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．79附录7六个自交系耐渍和一个渍水敏感自交系效果图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．85附录8根据死叶比例打分参考图⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．85发表和准备发表的论文⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯．．86致谢⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯⋯87 华中农业大学2012届博士研究生学位论文中文摘要玉米是全世界最重要的粮食作物之一。涝渍是热带、亚热带地区玉米生产的主要逆境胁迫之一，也是我国南方地区影响玉米最终产量的主要逆境因子之一。本研究旨在采用关联分析和连锁定位策略，针对玉米耐渍性的不同表型，利用96份自交系的关联分析群体进行候选基因关联分析，利用144份自交系的关联群体进行玉米45868个SNP的全基因组关联研究(GWAS)。同时，还利用BC2F2：3分离群体对显著关联位点进行连锁作图验证。取得了以下主要结果：1、利用EcoTILLING技术在96份自交系群体中，开展了候选基因zmbRLZ和Hemoglobin内SNP与耐渍性的关联分析。研究发现：候选基因zmbRLZ区段有33个SNP，多数位点的最小等位基因频率(MAF<5％)。测序鉴定10个SNP位点MAF大于5％，LD分析显示，部分位点之间有显著相关，其中5个SNP可以代表大部分的遗传多样性信息。关联分析的结果显示，有1个位点与耐渍响应性状的关联达到显著(P<0．005)。另有2个位点与耐渍响应性状的关联达到显著(P<0．05)。2、利用全基因组关联分析在144份自交系群体里鉴定了2个SNP位点(PUT．163a-93013517—4810、bin9．07，PZE．105105668、bin5．04)分别与正常水分下的RFW(根鲜重)和渍水处理下的SFW(茎鲜重)显著关联(p<2．18×10。6)。在825624次(45868位点×9性状×2环境)可能关联中，检测到27次SNP与性状的显著关联(p<2．18×10。5)，涉及到5个SNP位点；检测到141次SNP与性状的显著关联(p<2．18×10‘4)，涉及53个SNP位点。3、对性状的耐渍系数、死叶指数等次级综合性状的GWAS分析结果显示，3个位于第一染色体上的SNP位点与多个性状的耐渍系数显著关联(p<2．18×10巧)；但死叶指数没有检测到关联位点。以10kb作为一个单倍型分析的窗口进行基因型分析，在两种模型下同时检测到N4590位点(bin6．05)与死叶指数显著关联。4、利用BC2F2：3分离群体对关联位点(bin5．04，bin9．07)进行连锁作图验证，结果显示：以上两个显著关联位点在遗传连锁分离群体中均能定位到多个耐渍性状的QTL。T 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位5、对bin5．04，bin9．07中两个显著关联位点进行了候选基因的预测分析。其功能涉及到转录调节、胁迫响应、信号转导、翻译调节、能量代谢、活性氧物质生成和清除、蛋白降解、次级代谢和转运调节。关键词：关联分析连锁分析玉米渍水苗期 华中农业大学2012届博士研究生学位论文AbslractMaizeisoneofthemostimportantfoodcropsintheworld．Intropicalandsubtropicalregions，severecroplossesarealwayscausedbyprolongedseasonalrainfall．WaterloggingisalsoaseriousenvironmentalstressonmaizegrownatmaizeseedlingstageinsoutheasternChina．Totaketheconsiderationofthefinemappingbasedoncouplehundredspopulation晰tlllinkagedisequilibriumanalysis，QTLoftraitsassociatedwaterloggingresponsewereidentifiedthroughcandidate—basedassociationmappingperformedusing96maizeinbredlines，andGⅥ，AS(genomewideassociationstudy、donewith5610SNPusing144maizeinbredlines．Atthesametime，QTLoftraitsassociatedwaterloggingresponseWasfurtherprovedusingaBC2F2．3linkagemapping．Themainresultswereasfollowing：1．Candidate．gene．associationmappingWasconductedbasedonthecandidateszmbRLZandHemoglobinthroughEcoTILLn、IGinapopulationcomprisedby96maizeinbredlines．33SNPwerefoundintheregionof删别旺Zthoughsequencing．and10SNPwereidentified谢mMAF>5％．Someofthe10SNPshowedsignificantcorrelationand5ofthemmaystandformostofthegeneticdiversity．OneofSNPwassignificantlyassociated、析tllthewaterloggingresponsive仃aitinthelevelof0．005．AnothertwoSNPweresignificantlyassociatedwiththewaterloggingresponsivetraitinthelevelof0．05．．2．Outof825624(45868SNPX9traitsx2environments)possibleassociations．twoassociations伊UT．163a-93013517．4810bin9．07，PZE．105105668bin5．04)wereidentifiedthroughGⅥ，ASinthepopulationof144maizeinbredlines．whichsignificantlyassociatedwitllRFW(rootfreshweight)inthenormalconditionandsFW(shootfreshweight)underwaterlogging(p<2．18×10。o)，respectively；27associationswereidentified(p<2．18×10。)for5SNP；141associationswereidentified(p<2．18×101)for53SNP．3．Secondarytraits，WTC(waterloggingcoefficient)andindexofyellowleafwereestimatedandmappedbyGWASwith45868SNP．Consensusresultswerefoundonchromosome1forvarious、胛C佃<2．18×l0叼)，whichincluded3differentloci．NegativeresultexistedforindexofyellowleafthroughGAWSwith45868SNEAndLDanalysiswithhaplotypeforindexofyellowleafrevealeduniquelocus(N4590bin6．05)significantlyassociatedwithindexofyellowleaf．4．Thesignificant10CiidentifiedthroughGWASwerefurtherverifiedbylinkageanalysis．Thebin5．04—5．06iSincludedbytheQTLsconfidenceintervalandseveralQTLslocatedinbin9．06．9．07．ItdeducedthattwosignificantSNPmaybepositiveassociationloci．Predictedcandidatesareinvolvedinvariousmolecularfunctions，suggestingthattheyareimportantregionforbiologicalevents．KeyWords：associationanalysis，linkageanalysis，maize，waterlogging，seedlings 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位IV 华中农业大学2012届博士研究生学位论文1·前言1．1渍害对玉米生产的影响及研究渍害的重要性涝渍严重影响着热带、亚热带地区玉米生产。特别是东南亚地区，季节性降雨形成的涝渍影响到25％的玉米种植区域，平均每年造成15％左右的玉米减产(Rathore，1998)。中国南方玉米产区，在正常的栽培季节中，苗期常遇低温雨水，花期又遇持久梅雨，在地下水位高及排灌系统不良的土壤环境中，玉米根系处于长期低氧胁迫环境，渍害已成为限制南方玉米高产、稳产和扩大生产面积的重要非生物逆境影响因子。伴随全球气候的恶化，涝渍在全球范围内呈现蔓延之势(Ghassemi，1995)，探讨玉米耐渍性的分子机理，发掘和有效利用耐渍基因，创制耐渍性优良的玉米新种质，培育耐渍新品种是减少玉米损失，提高单位面积产量，扩大玉米种植面积的最为经济有效的途径之一(Zaidi，2004)。1．2作物渍害研究进展目前针对玉米、水稻、小麦、大麦、大豆等作物已经从不同学科开展了耐渍性研究。大量研究表明，渍水低氧逆境对各种作物在形态的表观水平、代谢的生理生化水平以及基因表达调控的分子水平上都产生了显著的影响，采用遗传定位策略开展了耐渍相关QTL的定位研究，克隆了部分耐渍基因并采用转基因技术进行了功能验证，利用MAS(分子标记辅助选择)技术获得了耐渍水稻新品系。1．2．1渍水对玉米形态、细胞学水平的影响受涝渍影响玉米不同程度地表现出叶片萎蔫变黄，茎叶变紫，叶片生长变慢，主胚根和次生根生长受到抑制并死亡，根系体积缩小(张祖新，2004)，不定根产生并露出土层(Mano，etaL，2007)；细胞学研究还发现受渍害胁迫的根系组织中形成了大量通气组织(Drew,elaL，2000；Subbaiah,elaL，2003)。1．2．2渍水对玉米生理生化的影响不同玉米材料在受到耐渍胁迫后，在生理生化水平上表现出显著的差异。 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位Mano等(200z)研究发现；在玉米萌发前浸水8天后，46份自交系的种子萌发率表现出显著差异(重复问的相关系数为0．415)，玉米苗期淹水2周后，以幼苗干重比(淹水／对照)为指标，223份自交系之间表现出显著差异(重复间的相关系数为0．464)。Zimmer(2002)等从玉米渍水研究中筛选得到19份耐渍和17份敏感的自交系，利用120个RAPD及155个SSR标记评价所有材料并从中择选基因型差异较大的材料为将来构建遗传定位群体的双亲。郝玉兰等(2003)研究了玉米不同生育时期渍水对生长发育的影响。结果显示，渍水导致细胞活性氧代谢失调，膜脂过氧化作用加剧，MDA(丙二醛)含量增加，过氧化物酶活性急速下降，玉米叶片叶绿素含量降低，体内保护酶活性与膜脂过氧化水平密切相关。Zaidi等(2004)研究发现，玉米发育的V2期(两叶期)对渍水最敏感，其次是v7期(七叶期)，Rl期(开花期)最不敏感，产量损失的也最少，发现了ASI(散粉抽丝间隔期)小于5天、早期不定根的伸长、主根孔隙度的增加及最终产量等与玉米耐渍性相关，可作为耐渍玉米鉴定的指标。Liu等(2010)研究发现，以苗高和干重WTC(耐渍系数：渍水测量值／正常测量值)为指标，玉米V2期(两叶期)比Vl期(一叶期)和V3期(三叶期)对渍水的反应要敏感，且渍水持续6天是最佳的时间：并通过渍水3天后的叶片退绿黄化的程度将渍水敏感分为5个等级，并鉴定出HZ32和Jia051两个耐渍性最好的材料；同时还鉴定出两个生理指标MDA的升高和POD(peroxidase，过氧化物酶)的降低程度和材料的渍水耐性也有着显著的关系。Tang等(2010)比较了MDA(脂质过氧化)和6种抗氧化酶(SOD(superoxidedismutase)，APX(ascorbateperoxidase)，GR(glutathionereductase)，CAT(catalase)和POD)在渍水敏感悬殊的两个自交系HZ32和K12之间的差异，发现敏感自交系K12的脂质过氧化水平显著提高，而渍水耐性自交系HZ32的脂质过氧化水平没有显著变化；推测叶中的CAT和根中的APX在清除H202起着最重要的作用，POD，APX，GR和CAT活性链接SOD在清除氧自由基和H202的过程中起着必要的保护作用。总体来看，利用生理指标的判定，发现不同材料玉米之间对渍水适应有着广泛的多样性。1．2．3玉米受渍水胁迫诱导的基因表达研究玉米的基因表达调控是应对渍水的一个重要的过程。Tang等(2005)对M017(敏感)和HZ32自交系(耐渍)在淹水处理2h条件下进行差异表达的EST比较分析，发现耐渍性不同的材料具有不同的耐渍相关基因的表达模式。Zhang等(2005)，通过芯片技术获得了与耐渍相关的三个候选基因。Zhang等(2008)研究渍水处理下玉米根系MicroRNA差异表达推测小RNA可能参与 华中农业大学2012届博士研究生学位论文到渍水响应的表达调控。Zou等(2010)选取耐渍自交系HZ32淹水处理后四个时间点(12h、16h、20h以及24h)的幼苗根系，构建正向SSH文库，以反向Northern技术进行筛选，证明玉米淹水后期的应答涉及功能各异的unigene基因共295个。建立了耐渍响应后期基因表达网络，其中氨基酸代谢过程是蛋白质降解和碳代谢途径的链接，参与了细胞质pH调节以及降解氨基酸碳架，并为糖酵解途径提供中间产物以支持能量供给，对淹水胁迫后期的响应起着重要作用。编码脯氨酰羟化酶基因P4H，其mRNA在转录后的选择性剪接调控与耐渍性有关(Zou，etal．，2011)；在研究zmbRLZ基因结构与功能的基础上，开发了基于SNP的CAPS标记，对该基因的定位结果与课题组前期通过遗传连锁定位的1个玉米耐渍性QTL的密集区域吻合(Qiu，eta1．；邹锡玲，2011)。Steffens等(2010)发现G蛋白被组成型激活时，通气组织能够在没有乙烯的情况下形成。Yamauchi等(2011)发现在渍水处理下玉米根系中一个与活性氧清除有关的基因MT只在皮层细胞中特异下调表达，这一变化会导致活性氧在皮层细胞中大量积累，从而引发PCD(细胞程序性死亡)的过程而形成通气组织。Rajhi等(2011)利用显微切割技术将玉米有氧与厌氧下的根皮层细胞与中柱细胞分离，利用表达芯片检测到皮层中575个差异表达的基因，而且差异表达的基因能够被乙烯抑制剂抑制，这些基因涉及到活性氧再生和清除、钙离子信号、细胞壁松弛和降解，这一发现将为解读玉米根通气组织形成的分子机制提供有益的参考。1．2．4玉米耐渍基因的遗传定位研究Silva等(2005)研究了渍水胁迫后玉米生物量的变化，并在染色体3、4和5上分别检测到3个控制地上部分干重的QTL，其中染色体3和4上的位点还控制地下部分干重。Mano等(2005a，b)将玉米淹水胁迫后不定根形成的相关QTL分别定位到染色体3、4、7和8上，并于2006，2007，2008，2009年相继又将通气组织形成的相关QTL定位到第1、5、9和10号染色体上，将死叶指数和地上部分干重QTL定位在第1染色体上。Qiu等(2007)定位了生物量变化的相关QTL59个，分布于除染色体5和8以外的8条染色体，其中染色体4和9上有主效QTL。Omori等(2007)将第2和3节根根脚QTL定位到染色体7。Mano等(2009b)利用NIL群体在第1染色体的1．06bin区域实现了一个通气组织相关QTL的精细定位。1．2．5水稻耐渍性状的研究Bailey—serres等(2010)综述了不同生态型的水稻品种淹水后，通过调节乙烯、脱落酸和赤霉素等激素水平，实现供氧和ATP、糖类、丙酮酸之间的动态 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位平衡以选择静息和茎的快速伸长等生存策略，进而提高逆境条件下的成活机率。在水稻中前人成功地应用图位克隆策略定位并克隆了在完全淹没(S珊J)和部分淹没(SKI)条件下主要响应基因(Xu，eta1．，1996；Hattori，eta1．，2009)。定位了水稻中与耐淹相关的QTL(Kamolsukyunyong，eta1．，2001)。Xu等(1996)利用RAPD和RFLP标记，在一个F2定位群体中将水稻的耐淹基因Subl定位在第九染色体上，距RFLP标记C1232约4个cM，可解释69％的表型变异。并且于2000年又利用2950个F2单株群体，精细定位了Subl。Xu等(2006)证实了SublA基因是一个类似乙烯响应因子的基因。Septiningsih等(2009)利用SublA功能标记，成功改良了多个品种的耐渍性；Singh等(2010)利用SublA分子标记调查并收集了大量耐性水稻资源。Septiningsih等(2012)利用含有敏感等位基因SUBlA一2的两个中等耐渍亲本，鉴定了3个新的耐渍QTL，并创造了更加耐渍的材料。Toojinda等(2003)定位了若干水稻耐淹主效QTL，其中一个效应最大的主效QTL被定位在第九染色体上。Siangliw等(2003)利用分子标记辅助选择的策略，将3个耐渍基因成功地转育到一个敏感品种，并且提升了该品种的耐渍性。在功能研究方面，Fukao等(2011)发现SUBlA-1有提高抗旱的作用是由于在淹水后植株叶片自然的脱水适应，进而推测它可能是淹水与干旱的共同调节因子。Parlanti等(2011)发现在静息和逃避策略的水稻中叶鞘通气组织的形成具有不同的机制：ROS的积累对静息策略的水稻叶鞘通气组织起作用，而乙烯的形成对逃避策略的水稻叶鞘通气组织形成起作用。Barding等(2012)研究发现含有抗性等位基因的品种M202的地上器官，SUBlA的出现与碳水化合物代谢的抑制是相关的，这和它限制淀粉代谢去提供伸长生长是一致的。在淹水条件下，丙氨酸，丙酮酸的代谢产物，在两个材料之间差异最大，但是谷氨酰胺，谷氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，苏氨酸和缬氨酸升高的水平在M202中也较M202(Subl)高。还发现淹涝胁迫后3天，AlaGly水平在两种基因型显著下降，但没有与评估的其他代谢产物一样在去淹水1日内恢复。水稻全淹时，SUBlA影响代谢组的动态变化，提供了为稳定易淹没地区作物产量，单基因引发静息策略的新见解。Steffens等(2011)发现H202起始水稻茎秆通气组织的形成。Takahashi等(2011)发现种子萌发时ADHl缺陷导致ATP下降，细胞分裂和伸长减缓是造成胚芽鞘伸长变慢的原因之一。Cho等(2012)发现SnRKI(蔗糖非发酵相关蛋白激酶1)活性精准地调节胁迫诱导基因的表达和胁迫耐受的诱导。尽管水稻的淹水状态和玉米有较大的不同，但是很多基因表达调控方面的研究有很好的借鉴作用。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文1．2．6大、小麦和豆类的耐渍研究Boru等(2001)发现小麦的耐渍性可能受4对以上基因控制，主要是加性效应，且不受母本基因型的影响。Burgos等(2001)用小麦RILs(重组自交系)群体定位到5个和淹水胁迫下存活率相关的QTL，能够解释表型变异的40．6％；10个与幼苗生长指数相关的QTL，能够解释表型变异的35．5％。Li等(2008)N用耐渍性差异显著的亲本构建了2个大麦DH(双单倍体)群体，以干重、植株存活率和叶黄指数为指标共定位了20个QTL，部分QTL同时影响多个性状，除Q(wt)4．1是干重和叶黄指数共定位外，其它都是植株存活率和叶黄指数共定位。VanToai等(2001)利用两个大豆RILs(重组自交系)群体208个家系定位到1个与涝渍胁迫条件下株高和产量显著相关的QTL，且在多个环境下均能被检测到与标记sat-064紧密连锁，并构建了含有该QTL的NILs(近等基因系)。而Reyna等(2003)将sat-064紧密连锁的QTL导入到一个新的遗传背景中进行评估，可能由于遗传背景和环境的影响，未找到QTL与耐渍性的明显关联。Comelious等(2005)利用170个家系的两个大豆RILs群体，用单标记分析检测到共同的5个标记与耐渍性显著关联，CIM(复合区间作图法)共同定位到1个QTL，能够解释10％和16％的表型变异，且增效基因来自于同一个抗性亲本。Pearson等(2011)利用多年生黑麦草143个RILs调查9个数量性状定位了37个耐渍相关的QTL。Malik等(2011)发现根中ROL(根际泌氧)屏障从大麦转移到小麦，提高了小麦的耐渍性。Colmer等(2011)综述了渍水引发氧气缺乏，造成能量冲突，给需要ATP进行主动运输的离子转运带来障碍是渍水最直接的影响，进而提出根的生长能力和根功能的改善是小麦耐渍性改良的方向。Vidoz等(2010)研究发现番茄在淹水后乙烯增加刺激生长素转运产生不定根。Mustroph等(2010)通过转录组跨界比较鉴定了保守和植物特有的低氧胁迫反应。1．2．7拟南芥耐渍性状的研究进展杨礼香(2005)将非共生血红蛋白基因转化拟南芥发现，植株的耐渍能力有显著的提高。Hinz等(2010)在拟南芥中研究同属于水稻的SublA亚家族的RAP2．2，表明该基因受乙烯诱导，基因超表达可以明显提高拟南芥的耐渍性，而基因沉默则使得植株对淹水胁迫抗性降低，它调控糖代谢和糖酵解途径的编码基因，同时也影响乙烯合成途径相关的基因。Licausi等(2010)在拟南芥中研究同属于水稻的SublA亚家族的HREl和HRE2。拟南芥转基因表达HREl，改善了缺氧的耐受性，而双敲除突变体hrelhre2比野生型更敏感。过表达HREl 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位植物表明在缺氧条件下丙酮酸脱羧酶和乙醇脱氢酶的活性增加，同时乙醇产量也有所增加，但在常氧下不会。全基因组芯片分析认为，缺氧条件下HREl过度表达，而不是HRE2，增加了最多的厌氧基因诱导。实时定量qPCR分析证实了HREl过度表达对几个厌氧基因的正向作用，而双敲除突变体hrelhre2表明，在4小时缺氧后相同的基因表达下降。从野生型单敲除突变体没有表现出显著性差异。因为HREl要求蛋白质的合成诱导，而HRE2不需要，推测低氧下HREl和HRE2调控依赖于不同的机制。HRE2可能受mRNA稳定的转录后调节。最后推测，在拟南芥低氧作用中，HREl和HRE2发挥部分重叠的信号提高厌氧基因表达和乙醇发酵，从而提高植物的耐受力。Gibbs等(2011)发现拟南芥中靶向蛋白水解的N．端规则通路是严峻的低氧含量的稳态传感器。Licausi等(2011)rE发现了植物通过N．端规则通路来调节厌氧的稳态反应。另外，Vashisht等(2010)调查了86个不同拟南芥品系的耐渍表现，以全淹水后半致死时间为耐渍性指标，这些品系之间的耐渍性存在显著差异，且耐渍性和水下叶柄伸长成负向相关。VanZanten等(2010)报道ERECTA(富亮氨酸重复受体样丝苏氨酸激酶)控制着乙烯诱导的膨大生长，而且它控制着乙烯处理缺失部位的叶片。Pena-Castro等(2011)在拟南芥中发现SUBlA具有开花抑制的作用。综上所述，拟南芥在耐渍功能研究方面有较大的突破和进展，水稻在这一方面也有成功的发掘。而且已经培育出很多耐淹水稻品种在生产实践中应用。小麦利用野生种资源和外源基因资源也创造了一些优良的材料。和这些植物相比，玉米的耐渍研究方面还处于探索阶段。21世纪之初引入植物遗传研究的关联分析方法，是找到耐渍重要基因和发掘优良基因资源的理想选择，并且结合传统的遗传连锁定位和关联定位的方法是当前遗传学研究的主要方法之一。1．3作物复杂性状的遗传解析复杂的数量性状多由微效多基因控制，分离群体中性状往往表现为连续的表型变异，采用经典的质量性状的研究方法不能准确地定位每个基因的位置和遗传效应。随着分子标记技术和分子数量遗传学的发展，可以将复杂数量性状的QTL定位在染色体上。当前对复杂数量性状的遗传解析主要采用基于连锁交换理论的QTL连锁定位和基于连锁不平衡理论的关联分析两种策略。6 华中农业大学2012届博士研究生学位论文1．3．1遗传标记1．3．1．1非DNA标记尽管遗传标记的种类较多，但能称之为有效的遗传标记，必须具备多态性、连锁性、全基因组的覆盖度高和易于操作、鉴定等特点。在遗传学和育种学中常用的遗传标记包括形态学标记(morphologicalmarkers)、细胞学标记(cytologicalmarkers)和生理生化标记(Physiologicalorbiochemicalmarkers)。形态标记数目少，对环境的影响敏感，环境因素对形态表型的影响较大。同工酶一类的生化标记和细胞学标记虽受环境影响较小，但鉴定，检测成本高，分析难度大，多态性低。1．3．1．2DNA标记1．3．1．2．1常规技术DNA标记DNA分子标记技术被广泛应用，是现代生物技术不可缺少的组成部份。目前，在各种遗传研究中使用的分子标记已经有几十种之多。基因组DNA的变异极其丰富，理论上分子标记的数目几乎是无限的，同时分子标记的检测不受基因表达的限制，非常有利于遗传育种研究对目标性状的标记和鉴定以及定位研究，提高了遗传标记在研究基因组和辅助育种中的实用性。DNA分子标记现在已经广泛应用于遗传多样性分析、遗传图谱构建、QTL和基因定位及克隆、基因差异表达分析、比较基因组学、系统进化研究、转基因植物鉴定、种质资源鉴定及分子标记辅助育种等各个方面。常规DNA分子标记以技术原理分类包括：以RFLP(限制性内切酶片段长度多态性)为代表的基于分子杂交技术的分子标记(Saghai．Maroof,ela1．，1984)；基于PCR(聚合酶链式反应)技术的分子标记，如SSR(简单序列重复)(Litt，etal．，1989)、RAPD(随机扩增多态性DNA)(Williams，ela1．，1990)、AFLP(扩增片段长度多态性)(Zaberu，eta1．，1993)、ESTs(表达序列标签)(Kurata，eta1．，1994)等。RFLP标记多态性中等，可信度高，但技术要求和费用较高，限制了在遗传改良中的广泛应用。基于PCR技术原理的分子标记，如SSR、RAPD、AFLP、ISSR、SCAR、SRAP、TRAP、CAPS、EST等技术操作简单、费用低并且多态性较为丰富，在作物遗传改良中被广泛使用。 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位1．3．1．2．2基于混池技术高通量标记—．EcoTILLING复等位基因的发掘对于全面认识一个基因的功能具有十分重要的意义。2008年玉米B73全基因组测序完成之后，又提出了一个新的挑战课题，即基于不同玉米材料间的遗传差异较大，B73作为参考序列的局限性，导致等位区段的序列比对和等位基因的开发较为困难(Slade，eta1．，2005；Konishi，eta1．，2006；Bao，eta1．，2004)。TILLING技术的开发，使其核心检测手段可用于自然群体的等位基因的检钡1](Comai，eta1．，2004)，其原理是利用CelI酶切PCR产物中的异源双链部分，产生两条大小各异的条带，纯化的酶切产物被独特的双色荧光标记，在LICOR4300上电泳，同时得到两个扫描频道的图像。如果在两个扫描频道下的条带大小之和等于PCR产物的长度，就证明确实有这个变异位点(McCallum，eta1．，2000b)。对于不同生态型等位基因之间的差异分析，通常都利用直接测序的方法。但如果考察的生态型材料很多时，直接测序方法成本昂贵(TillBJ，eta1．，2006a)。由TILLING技术衍生的高通量，低成本，高效率的Eco．TILLING检测技术便成为当前普遍采用的技术之--(McCallum，eta1．，2000a，b；Comai，eta1．，2004；Henikoff,eta1．，2004；Jian，eta1．，2005；Cordeiro，eta1．，2006；Gilchrist，eta1．，2006；Till，eta1．，2006a)。随着技术体系的不断完善和改进，针对单链特异核酸酶的序列偏爱性和不稳定性，改用能切割所有单碱基错配的CelI单链特异核酸酶，在已知碱基错配位点的基础上，设计双色不对称荧光标记的引物，在一次混合4样本或8样本中，能够准确地检测到7个点突变(Colbert，eta1．，2001；Till，甜a／．，2004)。拟南芥是研究植物基因功能组学的模式植物，因而也成为最早被用于开展EcoTILLING研究的植物。Comai等(2004)对150个不同个体的5个基因，利用EcoTILLING检测出包括SNP，indel和SSR等类型的55种单倍型突变。表明EcoTILLING能够在许多个体里快速检测变异。美国MAIZETILLINGPROJECTS启动了玉米EcoTILLING的研究工作(http：／／genome．purdue．edu／maizetilling／EcoTILLINGhtm)。EcoTILLING技术在鉴定多态性及存在的单元型、检验异交繁殖物种的遗传杂合度等方面较全基因组测序更具优势。1．3．1．2．3基于单碱基延伸的高通量SNP标记基于分子杂交技术的SNP芯片，在光电技术的支撑下，成为一项高通量的发掘SNP标记的技术之一。其基本技术原理是探针杂交和单碱基延伸。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文目前，关于寡核苷酸的芯片有：根据寡核苷酸探针组(oligopoolarray，OPA)所设计开发的GoldenGate芯片，包括了1536个来覆盖全基因组随机序列的SNP标记和Panzca数据库(www．panzea．org)中430个优异的SNP标记(McMullen，eta1．，2009，Yan，eta1．，20LO)；抗旱候选基因芯片，由582个座位的1536个SNP标记组成(Yah，eta1．，2009)；改进的抗旱候选基因芯片，由抗旱候选基因SNP芯片中高质量、高多态的943个SNP标记和从Panzea数据库中选择的593个优异的，可设计性评分高于O．6的SNP标记共同组成(卢艳丽，2010)；以玉米NAM(nestedassociationmapping)群体的27个亲本为基础材料，制作的覆盖全基因组56110个SNP位点的大规模的SNP芯片，MaizeSNP50K，涉及19540个以上的基因位点，平均跨度为40Kb。利用1536SNP芯片构建了NAM群体的5000份重组白交系组成的巢式关联作图群体的基因型，其中1106个SNP标记被定位到连锁图谱dP(McMullen，eta1．，2009)。MaizeSNP50K芯片已在玉米基因组学的研究中得到了的应用(Weng，eta1．，2011；Riedelsheimer,eta1．，2012)。1．3．1．2．4终极标记技术—．DNA序列分析(DNA测序)测序是最直接的得到个体之间遗传差异的终极标记技术。显然，昂贵的测序成本使得这一终极标记技术难以被广泛的应用。第一代测序技术是以Sanger的双脱氧核苷酸末端终止法为基础，结合ddNTP的四色荧光标记和毛细管电泳技术，可在一个反应体系中进行序列分析，使得读带的并行性和自动化程度得以提高。第二代测序技术包括：(1)基于焦磷酸测序原理而建立起来的Roche454高通量基因组测序技术，使并行性和测序速度大大提高，成本大幅度下降。每次运行能产生100万条序列，平均读长能达到400nt，且第400个碱基的准确率能达到99％。一次运行所需时间为10小时，能获得4-6亿个碱基的序列信息。(2)基于单分子簇的边合成边测序技术和专有的可逆终止化学反应原理(reversibleterminator)的IlluminaSolexa和ABISOLID为代表的高通量基因组测序技术。每次运行最多可产生200GB的数据量。利用第二代边合成边测序的技术，对玉米NAM群体的27个亲本自交系的测序结果比对，得到了第一张玉米的HAPMAP(Gore，eta1．，2009)。通过impute的方式返回到NAM的5000个RILs中，结果迅速地被应用到了后来的连锁定位(Buckler,eta1．，2009)$N全基因组关联分析当中，发挥了重要的作用(Kump，eta1．，2011；Tian，eta1．，201l；Cook，ela1．，2012)。Lai等(2010)禾lJ用这一技术对6个重要的玉米自交系进行测序分析。美国对3000个玉米白交系的测序计划已经结束(Zhang，eta1．，2012)，墨西哥支持八千万美元开展种质资源的测序计划。水稻利用高通量测序得到了 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位513个水稻品系的信息(Huang，etal．，2010)。利用第二代测序技术进行生物全基因组的重测序(resequencing)，在全基因组水平上扫描并检测突变位点。在转录组水平上进行全转录组测序(wholetranscriptomeresequencing)，开展可变剪接、编码序列单核苷酸多态性(cSNP)等研究：进行小分子RNA测序(smallRNAsequencing)，分离特定大小的RNA分子进行测序，发现新的microRNA分子。在转录组水平上，与染色质免疫共沉淀(ChJP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技术相结合，检测与特定转录因子结合的DNA区域和基因组上的甲基化位点等。1．3．2分析方法QTL定位是通过分子标记与数量性状的表型值间的统计分析，即标记与特定性状连锁时，不同标记基因型个体的表型值间会出现显著差异，以此确定数量性状基因座位在染色体上的位置和效应，以及各个QTL间、QTL与环境之间的互作效应。遗传学的分析方法有很多，但这里要探讨的是基于群体的遗传定位方法，根据群体的特点构建的双亲重组交换的群体以及搜集的自然群体包括自交系或者地方种质。针对两种不同的群体，开发了不同的分析方法，即针对双亲群体的连锁分析(1inkageananlysis)，针对自然群体连锁不平衡的关联分析(associationanalysis)，和将以上两种群体联合的分析方法，以及基于极端表型混池分析(Bulkssegregationanalysis，BSA)。1．3．2．1连锁分析连锁分析是利用两个亲本杂交，后代染色体的重组分离来定位数量性状位点和克隆基因的方法。该方法利用创造的重组交换来确定影响性状的遗传因子的位置和效应。这种方法已经被成功地应用克隆了不少基因，目前为止，图位克隆得到的基因基本都是利用这一方法完成，例如玉米的tbl(Doebley,eta1．，1995；Doebley，eta1．，1997)，vgtl(Salvi，eta1．，2002)，水稻的SUBJ『(Xu，eta1．，2006)，SKl(Hattori，eta1．，2009)，番茄的加2．2(Frary,eta1．，2000)。1．3．2．1．1群体构建根据研究的进展和精度要求，群体分为：初级作图群体(F2，BC2F2，RIL，DH，IF2)，次级作图群体(NIL)和高级作图群体(SSSL)。初级作图群体的定 华中农业大学2012届博士研究生学位论文位精度一般在10cM；次级作图群体可以精确到0．1cM；高级作图群体背景更加一致，QTL效应分析的更加准确，对于细小QTL的检测更加有效，同时可以进行多次表型重复和环境互作分析，到达O．1cM甚至10Kb以内来图位克隆基因。初级群体根据群体的自繁保存能力可以分为临时性群体和永久性群体。象F2：3家系这样还在分离的群体，构建时间比较短，但是，材料还在分离，种子不能永久保存，重复表型次数受种子的限制；后来经过不断自交得到RIL群体或者单倍体育种得到的DH系和在此基础之上的永久F2群体，这样就有了充足的种子可以进行多次重复的表型考察，同时，由于其定位精度的原因，这些都是初级定位群体。次级定位群体，通常是在初级定位群体的基础之上，通过不断的回交或自交得到有限个位点的NIL，在此基础之上，进一步构建的F2群体。这样的群体必须是一个较大的群体，才能够确保在小的区间发生重组交换，进而精细定位QTL。高级作图群体，即染色体单片段代换系(SSSLs)，大多数次级作图群体中含有不止一个供体的染色体片段，QTL分析存在遗传背景干扰。染色体单片段代换系(SingleSegmentSubstitutionLines，SSSLs)是用于遗传学研究的理想材料，它是利用杂交、分子标记辅助回交选择的方法，获得的与受体在遗传背景上只有一个染色体片段差异的代换品系。除特定的染色体片段来源于供体外，该品系其它遗传组成与受体完全相同。所以利用单片段代换系进行QTL分析，可以完全消除遗传背景的干扰。进而可以将复杂的性状拆分成简单性状，将QTL看作孟德尔因子进行分析。单片段代换系可以作为永久性研究材料，经过重复和多年多点试验，可以减少试验误差并分析QTL与环境的互作。代换片段的聚合，完成相似遗传背景非等位基[因(QTL)fu-J_E位性效应的研究。Talukdar(2003)对52个SSSLs的22个性状的QTL分析中，检测到了234个QTL。Liu等(2004)在12个SSSLs的18个性状的QTL分析中，共检出70个QTL。通过SSSLs检出的OTL数量远远超过利用其它群体检出的QTL数。SSSL内供体染色体片段的单一性，完全消除了遗传背景及QTL之间互作的干扰，便于鉴定出功能微效的QTL。SSSL是一个良好的永久作图群体。覆盖全基因组的一套SSSL可以用于全基因组QTL的检测与剖析。SSSL文库实际上是在受体的遗传背景上，构建活体的供体基因组文库。SSSL文库的构建达到了常规育种和QTL定位研究有机的结合，让QTL分析的理论结果可以尽快应用于育种实践。这样的SSSL文库可以作为一个较高层次的材料平台，对进一步的遗传理论研究及育种实际工作，都具有非常重要的意义。 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位1．3．2．1．2定位方法在统计学上，数量性状定位方法有回归、贝叶斯和最大似然法三种模型。QTL定位方法主要是SMA(singlemarkerapproach，单标记分析法)，IM(Iniervalmapping，区间作图法)和CIM(compositeintervalmapping，复合区间作图法)(王建康，2009)。SMA是根据单因素方差分析，检测各个标记位点不同基因型间的目标性状差异显著性，判断标记与性状关联的方法，该方法的优点是无需完整的遗传连锁图，但是只能在目标QTL与标记位置恰好重合且每条染色体只有一个QTL时，定位才能准确。IM采用极大似然估计和简单线性回归模型，同时分析两个相邻的标记，根据两个标记之间存在QTL和不存在QTL的似然函数的对数(LOD值)判断QTL的有无，同时估计其位置和效应(Lander,eta1．，1989)。该方法假定单条染色体上只有一个QTL，如果存在多个QTL时就会在中间出现“幻影”QTL，则定位QTL的位置和效应都会出现偏差。CIM是最常用的基于双亲杂交群体的定位方法。它结合了IM与多元线性回归模型，背景标记作为协变量消除IM在同一染色体上有多个QTL时出现的“幻影”QTL(Zeng，1994)。但该法控制背景采用测试区域内QTL的效应和标记变量的回归系数，同样的标记可能随着其在染色体上的区域有不同的系数，造成估计QTL效应有偏。此外，选择不同的背景标记可能得到不同的定位结果。同时，该法不能分析位点之间上位性和位点与环境间互作，而这些遗传效应同样不可忽视。为了弥补该法的不足，研究者对其模型做了改进。Kao等(1999)提出了MIM(multipleintervalmapping，多元区间作图法)，它能估算单一QTL的效应以及QTL间的互作效应，但是不能分析QTL与环境的互作效应。Li等(2007)提出ICIM(Inclusivecompositeintervalmapping，完备区间作图法)，该法有效地控制了背景遗传变异对定位的影响，首先，它对所有标记做逐步回归，选择需要的标记并估计其效应，再通过逐步回归得到的线性模型去校正表型数据，加(显)性效应QTL通过一维扫描定位，上位性互作QTL通过二维扫描定位，最近他们新开发的软件已经能分析QTL与环境之间的互作效应。浙大朱军研究小组提出MCIM(mixedmodelbasedcompositeintervalmap，基于混合线性模型的复合区间作图法)，该方法分解了控制复杂性状的QTL，将单个位点的效应(加、显性)作为固定效应，位点问的上位效应和位点与环境间的互作效应当作随机效应，对多个环境下的性状做联合定位，提高作图的精度和效率，同时，将控制背景变异的标记效应归为随机变量，对QTL位置和效应的无偏估算没有影响(Yang，eta1．，2007；Yang，eta1．，2008)。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文1．3．2．2关联分析AM(associationmapping，关联作图)或LDM(1inkagedisequilibriummapping，连锁不平衡作图)在21世纪初从人类疾病研究的方法中引入植物遗传研究。它是一种研究表型变异与遗传多态性之间基于连锁不平衡分析的方法(Zondervan，etal．，2004)，伴随着大量单核苷酸多态性(SNP)检测技术的出现，这种方法快速成为主要的剖分植物复杂性状遗传结构的方法之一。到目前为止，植物里的AM研究多是采取了目标性状相关的候选基因组成的一套分子标记开展研究，在基因组学快速发展的背景下，不久的将来可以实现对任何植物进行真正意义的GWAS(genomewideassociationstudy，全基因组关联分析)(Rafalski，2010；Ingvarsson，etal．，2011；Yan，etal．，2011)。该方法已经应用到了玉米(Belo，甜a／．，2008；Yan，eta1．，2010；Yang．，etaL，2010；Kump，eta1．，201l；Tian，eta1．，2011)、水稻(Huang，eta1．，2010)、小麦(Breseghello，eta1．，2006)和拟南芥(Atwell，etal．，20LO)，并且在一些复杂数量性状的研究中得到了不错的结果，例如，水稻开花时间和产量(Huang，eta1．，2010)，玉米籽粒成分(Cook，eta1．，2012)、小斑病抗性(Wisser,eta1．，2011)和大斑病抗性(Kump，eta1．，2011)。关联作图常用两套策略，即基于全基因组和基于候选基因的关联分析。全基因组扫描方法一般采用随机分布于基因组上的标记对所选材料进行全基因组的基因型鉴定；但基于候选基因的关联分析只针对目标候选基因进行基因型的鉴定。对特定群体来讲，关联作图的策略选择和分辨率取决于该群体内LD的程度以及等位基因或者单倍型的频率。对高度LD水平的群体(即群体在很长的物理距离内存在LD)而言，全基因组扫描需要的标记相对较少，可以作为一般精细定位研究的工具，而对候选基因进行关联分析，得到的结果由于作图精度受LD限制，支持候选基因与性状的关联，但不能排除其LD区间内其它基因对性状的作用，故证据的效力还不充分。而较低LD水平的群体(即群体的LD在很短的物理距离内迅速衰减)则适宜采用基于候选基因的高分辨率作图方法，同时可以创造足够多的分子标记进行全基因组扫描发掘新的位点和准确评价基因效应。基于候选基因的关联作图，如果控制目标性状的基因不在候选基因之列，基于候选基因的关联作图就无法全面解析目标性状的遗传构成。同连锁作图比较，LD作图有4个优点：通常以现有的自然群体为材料，不必构建专门的作图群体，所以花费的时间少，成本低；一个自然群体同时可作为多个性状QTL定位的材料；精度高，可达到单基因的水平；广度大，可同时检出同一座位的复等位基因。如用SNP标记进行LD作图，虽然一个座位只有两个等位基因，但是通过构建单倍型，能显著地增加等位基因数，从而提高作图效率。 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位1．3．2．2．1群体构建无论是LM(连锁作图)还是AM(关联作图)都不可能在没有可鉴别的多样性情况下开展，所以，表型和DNA水平的多样性是构建群体时需要考虑的问题。玉米具备惊人的表型变异：成熟期株高可以在0．5米到5米之间变化，开花期在2个月到11个月之间变化，雌穗和籽粒的颜色、长度、大小和性状各有不同。LD作图主要依据就是LD衰减的距离，这一距离除了受遗传距离的影响之外，还有很多因素会影响LD，包括遗传漂变、自然和人工选择、交配体系以及和其他群体的混合(Flint-Garciaeta1．，2003；Gauteta1．，2003；Yuela1．，2006)。根据已有的研究案例，玉米中LD衰减可以从地方品种的不到lkb(Tenailloneta1．，2001；Gore，eta1．，2009；Yan，eta1．，2009)至uJ优良育种系的100kb(Chingeta1．，2002)。这就要求大量的标记才能够覆盖全基因组。通过比较27个不同玉米自交系，几百万的SNP和indels被鉴定(Gore，etal．，2009)。上述的自交系，采用与共同亲本B73杂交的方式得到了5000RILs系，所有的RILs经过了1536SNP的基因型鉴定，再通过亲本的测序结果将160万的SNP信息整合到每一个RILs中。因而，这些个体的SNP信息和多重单倍型(不同等位基因的组合或者一个基因内部的SNP组合)可以用来检测与几乎所有性状的关联，这一种质平台能够解释性状多样性的绝大多部分遗传基础(Li，甜a／．，2005；Zhu，eta1．，2008)。然而，上述的规模不是一般的研究项目所能提供的，所以针对不同的研究阶段和目标，可以选择不同的建群模式。选择不同的关联作图群体就可以做到不同的精度，越优良的自交系群体具有越大LD衰减距离，多样性越丰富或者外来种质具有较小的LD衰减距离。与之相伴的是，优良自交系群体可以做到标记与性状明显的关联，需要的标记数相对较少，定位精度低；而多样性更丰富的群体则需要更多的标记，定位精度高。Yan等(2011)综述了玉米研究领域里的关联群体，从几十个到几百个不等，包括优良自交系，多样性自交系和地方品种等等。而目前在玉米NAM(巢式关联作图，nestedassocimionmapping)群体5000个RILs的基础之上，又加入3000个自交系，将群体扩建到了8000个系(Zhang，eta1．，2012)。1．3．2．2．2定位方法定位的方法主要有GLM和MLM，以及逐步正向回归。这些方法之间的主要区别是控制假阳性。而群体结构是造成假阳性的主要原因。另外，个体之间的亲缘关系在关联分析中也作为控制假阳性的参数，Stich(2008)报道了多种评 华中农业大学2012届博士研究生学位论文价个体之间亲缘关系(K)的方法。有以下几个方法用在关联分析中控制群体结构的影响：基因组控制(Devlineta1．，1999；Mackayeta1．，2007)，结构化的关联分析(Pritchardeta1．，2000；Falusheta1．，2003)，主成分分析PCA(Pattersoneta1．，2006；Priceeta1．，2006)，非量度的多尺度缩放排列nMDS(Zhuet讲．，2009)，非一元化的混合模型(Flint-Garciaeta1．，2005；Yueta1．，2006；Zhangeta1．，2010b)。结合PCA和nMDS的二阶尺度测算方法被证明能够最好地反应关联平台的群体结构从而最大化地去除假阳性，同时还能在最大统计效力下鉴定真实的关联(ZhuandYu，2009)。在TASSEL软件执行的关联分析运算中，采用GLM或者(compressed)MLM的差别，在于是否引入参数K。考虑到标记数目巨大情况下运算速度的现实性，目前多应用TASSEL软件进行运算，即单标记分析的思路。还有研究者提出逐步正向回归的方法(Stichetal．，2008)，但逐步正向回归运算的速度无法完成全基因组的关联分析。1-3．213联合连锁分析和关联分析Lu等(2010)人提出将连锁与连锁不平衡联合在一起分析具有更高的检出能力。无论是连锁作图还是LD作图，单独使用都存在一定的局限，应结合连锁作图和LD作图两种方法以提高QTL定位效率(Myleseta1．，2009)。Manenti等(2009)结合这两种方法对小鼠进行了全基因组范围的肺癌QTL定位，其结果表明LD作图假阳性概率很高，但通过连锁作图可对LD作图的结果进行验证，以去除QTL伪关联，其中只有PasI位点在两种方法中得到证实与肺癌QTL相关。近几年来，研究者也发展了许多统计方法以整合连锁作图和LD作图(W．ueta1．，2001；Meuwisseneta1．，2001；Wueta1．，2002；Blotteta1．，2003)。为了结合这两种方法，研究者在玉米研究中发展了NAM群体。一方面通过人工配制的杂交组合来减少群体结构的影响，另一方面，以25个杂交组合所产生的大量后代为作图群体，为连锁作图提供了很高的统计效率(Y，ueta1．，2008)。然而，不能确定需要多少个骨干白交系才能够获得所希望的遗传变异。利用较多的自交系所组成的自然群体与不同系列的双亲本分离群体相结合，可能是进行联合作图的有效方法。整合作图结合了两种类型的作图群体，使得其作图群体样本增加，作图效率高于单独的连锁作图和LD作图。两种方法优势互补，是遗传研究的重要出路之一。联合两种作图方法，在分析时有两种方案，一种是连锁作图和关联作图分开进行，在结果比对时结合在一起分析。通过在区段上的吻合性来判定定位的一致效果。将一致的位点作为重点研究的对象。这样的做法，实际上并没有很好地克服由于低频等位基因造成的关联作图没有统计效力的困难。还有一种方 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位案就是将连锁和关联分析所有的材料结合在一起进行关联分析。这样就能够将部分的低频等位基因的频率提高，进而在分析中具有统计效力。在基于NAM群体的一些研究中普遍采用了将数据联合分析的策略(Kumpet讲．，2011；Tianeta1．，2011)。在利用同样的标记进行分析的连锁和关联群体里，都可以采用联合分析的方法。而在没有利用同样一套标记进行基因型分析时，就只能平行地进行连锁和关联分析。例如在玉米抗丝黑穗病(Weng，eta1．，2012)、籽粒的脂肪酸含量(Li，eta1．，2011)研究中，就采用了平行分析的方案。1．3．2．4极端集团分析BSA法(极端集团分析，BulkedSegregantAnalysis)，是利用两侧表型极端个体集合来初步定位与该表型相关的基因位点的方法。其他一些实用和快速的QTL分析方法也得到探索和应用，如选择性基因鉴定(selectivegenotypinganalysis)。这种方法是指从分离群体中选择表型极端的个体或家系进行基因型鉴定，然后通过检测这两类个体间等位基因频率的差异，发现与性状关联的分子标记(LebowitZeta1．，1987)。该分析方法的优点是能够筛选很大的群体，节省对所有个体进行基因型鉴定所需的时间和成本，缺点是只能检测到效应很大的QTL，并且其效应估计值可能存在偏差。结合DNA池分析和极端表型选择(bulkedsegregantanalysis)，BSA是鉴定与主基因关联的分子标记的最简单和最便宜的方法，因为这种方法只需要表型极端的材料分别组成DNA池，然后进行基因型鉴定分析(Giovannonieta1．，1991；Michelmoreeta1．，1991)。Quarrie等(1999)禾iJ用BSA方法对两个不同遗传背景的群体进行了耐旱性QTL分析，从每个群体选取50个植株组成DNA池，结果表明应用BSA进行QTL分析的结果与其它研究结果有很大的相似性。此外，该方法已成功地运用于不同的植物，通过AFLP和SSR等标记进行单个主基因或多QTL的遗传作[訇(Villaretal．，1996；Zhangeta1．，2002)。然而，这种分析方法也存在几个问题：(1)标记密度不够(如15．25cM)；(2)由于群体较小，检测QTL能力较低，只能检测较大效应的基因或QTL；(3)基于凝胶检测系统难以对DNA池间等位基因频率的差异进行有效的估计。1．4研究目的与意义：在玉米里，3000个家系组成的双亲群体可以精确定位到单基因水平(Wang，eta1．，2005)。尽管由于LD衰减在基因组不同的区段差异很大难以一概而论，但是类似的结果可以在200个系左右的关联作图中获得(RafalskiJA，2010)。本 华中农业大学2012届博士研究生学位论文课题组前期对于玉米耐渍性状通过双亲F2：3群体的定位研究找到了几个重要的位点，但是定位的精度不够，本研究利用关联分析可以在小群体达到精细定位的原理，选择遗传类群广泛、遗传结构合理的96份和144份玉米材料，分别利用候选基因和覆盖全基因组的MaizeSNP50K芯片(56110SNP)进行耐渍候选基因和全基因组基因型分析，对96份试材2次试验4次重复和144份试材3次试验6次重复的盆栽渍水胁迫下的多个苗期耐渍相关表型进行鉴定和关联分析，精细定位并发掘新的耐渍基因，鉴定优良耐渍等位基因，开发功能标记。为下一步阐明耐渍机理奠定基础和提供操作的对象。同时，为分子标记辅助育种提供靶向标记。2．材料与方法2．1．材料：96份自交系群体共计96份自交系(附录4)。玉米育种室长期收集的来自全国各地育种自交系资源147份，经过种子活力鉴定、播种出苗信息考察、田间生长发育形态的一致性鉴定、花期相遇的优劣以及在种植地武汉特殊的地理位置下土壤微环境和2006年的气候大环境的综合影响下产生的种子收获信息以及穗部性状一致性的信息，并通过2007年重复鉴定的结果，最终抉选了系内单株之间性状一致性高、种量丰富的96份自交系材料进行了后续的表型和基因型的调查。144份自交系群体144份自交系(附录5)。在96份的基础之上通过向多家育种单位索求自交系资源，通过引种后2008年武汉、海南两次适应性种植鉴定、筛选繁殖，选定173份自交系(WangM，eta1．，2011)，并对其进行85个SSRs的评价、群体结果和遗传距离信息的考察；综合考虑信息的冗余和财力状况以及商业化芯片对样本数的要求，最终抉选出144份优良的具有多样性代表的自交系组成一套群体，进行了后续的表型和基因型考察。连锁分析群体由耐渍抗性材料HZ32和耐渍敏感材料K12(轮回亲本)组配，总共有由180个BC2F2个体自交后得到的BC2F2：3家系群体(汤彬，2011)。 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位2．2．方法：2．2．1．盆栽的方法及表型考查表型评价96份自交系群体开放条件下的两次渍水试验。总共2次盆栽试验在华中农业大学试验基地开展。昼夜温度为39／150C，光照周期为13／1l小时。生长的土壤条件和渍水处理按照邱Qiu等的方法(2007)。试验按随机区组进行两次重复。每次重复每个基因型包括6个花钵，其中3钵处理和3钵对照。两叶期进行渍水处理，在经过6天的渍水处理之后采集每个自交系的15株在两种条件下的表型数据。处理、取样及表型测定按照邱等的方法(2007)。两个条件下调查了六个性状：分别是苗高(SH)、根长(I也)、茎鲜重(SFW)、根鲜重(RFW)、茎干重(SDW’)和根干重(RDW)。计算了总鲜重(TFW=SFW+RFW)、总干重(TDW=SDW+RDW)和总长(TL=SH+RE)。同时还考察了叶片的两个生理指标MDA和POD的水平。POD活性和MDA含量测定实验参照李合生(2000)主编的《生理生化研究法》进行。144份自交系群体开放条件下的三次渍水试验。总共三次盆栽试验在华中农业大学试验基地开展。昼夜温度为36／1oC，光照周期为13／1l小时。生长的土壤条件和渍水处理按照Qiu等的方法(2007)。试验设计和调查方法同上。180个BC2F2：3家系也进行了相同的表型调查。所有这些性状也进行了连锁和关联分析。同时考察了衡量叶绿素的叶绿度(TYS．3N植物养分速测仪，浙江托普仪器有限公司)以及整体指标死叶指数也进行了关联分析。两个条件下调查了叶绿度直接读取仪器测定的多株第三叶叶尖(非死叶部分)平均值。渍水处理下调查了死叶指数，其计算方法为，即打分标准：第一叶、二叶和三叶根据前期的调查面积大小的比值，基准分值分别记为2，4，6分，死叶所占面积乘以每叶的基准分值，相加之后得出死叶分值，然后平方后除以总叶数得到死叶指数，附录8中展示了不同分值的样本(附录8)。耐渍系数的定义为：性状渍水处理的值除以相同性状正常条件下的值，例如：总鲜重耐渍系数fwTFW，waterloggingcoefficientoftotalfreshweigh0=TTFW(渍水处理下的总鲜重)／CTFW(jE常条件下的总鲜重)。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文2．2．2．基因型鉴定2．2．2．1DNA提取关联分析的自然群体随机选取苗龄30天的自交系6株，混合其叶片按照标准的CTAB法提取总的DNA(Saghai—Maroofeta／．，1984)。连锁分析的BC2F2单株取叶片按照标准的CTAB法提取总的DNA(Saghai—Maroofeta／．，1984)。2．2．2．2SSR和EcoTILLING分析针对96份自交系群体利用71个SSRs标记进行了结构分析(常规的SSR标记的反应体系和PCR程序，PAGE检测方法：具体方法参见汤彬学位论文)(汤彬，2011)。71个SSRs分布于10条染色体，详细信息见附录3，标记结果用于分析群体的结构。候选基因：选择候选基因的标准：一是实验室前期基因差异表达研究中已经找到的候选基因，另外就是已经证实能够提高耐渍能力的基因。这一标准是出于以下考虑：选择前人得到的候选基因，既是对于前期工作的深入，还可能发掘新的功能位点，但风险大，因为当时的研究多针对功能已经清楚的基因，而本实验选择的基因可能没有预期的效果；基于此又选择了理论上更为可靠的基因。当时认为转化证据充实的基因应该具有这样的特点，所以选择了下面的两个基因做尝试。候选基因：名称来源zmbRLZ基因。选用玉米渍水敏感自交系M017和渍水耐性自交系HZ32，在幼苗二叶一心时进行渍水处理，利用上述2个材料渍水处理1h、2h、4h和对照的根部mRNA与s．M017舳鼢3均一化全生育期文库克隆中优选的PCR产物点制的cDNA芯片杂交，根据在渍水后敏感自交系与耐性自交系及其与对照具有显著差异表达的结果在该cDNA文库中筛选到一个编码碱性亮氨酸拉链基因的基因，命名为zmbRLZ。邹锡玲(2011)研究发现它在2个不同耐渍性材料HZ32(耐渍)和M017(渍敏)淹水胁迫下具有不同的表达模式；开发该基因的功能分子标记及利用F2：3群体连锁遗传定位到重要的耐渍QTL区间9．05bin(Qiu，eta1．，2007；邹锡玲，2011)。非共生性血红蛋白(AF291052．1，zeamayssubs．parviglumis)该类基因在转化拟南芥后能够显著提高耐渍的能力选择。当时将关联分析作为一种提升候选基因能够提高耐渍能力的证据的一个方法。两个耐渍候选基因zmbRLZ和Homeglobin进行了基于EcoTI[。LING技术的序列分析。EcoTILLING简易流程：多样性群体材料的种植，群体的取样，DNA大样抽提纯化，调节样品浓度，样品同参照(B73)混合。 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位基因特异性引物设计和筛选，PCR反应(附录l、附录2)，样品处理后酶切，电泳检测，抓图，分析。将结果分类，确定多少种单倍型，选取每种单倍型的一两种材料的PCR产物去测序(TillBJ，eta1．，2006b)。引物信息：zmbRLZ扩增目标大小为1185bp，以AZM4—33981的序列为模板设计(1881．．3065)：zmbRLZforward：CGCCAAACATGATACTGCCCTGCT；zmbRLZreverse：GTTGGACCCCTGAACGCATCACTC．HemoglobinAF291052．1(67．．868；GC％60．2％)：Hemoglobinforward：AAGTCGTGGGCCGTCATGAAGAAG；Hemoglobinreverse：ATCGGGCTTCATCTCCCGCTTGATCelI酶切体系酶切混合物：CelI工作液lul(Cellstock5ul；BufferB95u1)；10*buffer3ul；ddH2016ul。EcoTILLINGProtocoll，在冰上准备PCR反应的Mixture(最后在暗处加入荧光引物，混匀)；2，暗处操作，配制PCR反应体系；3，PCR反应约3小时后，将产物转移到新的PCR板，加入配制好的CelI的酶切混合物(以前纸质的资料有配比)；4，PCR仪器上进行45℃酶切15分钟；5，加入预先配好的63ui无水乙醇：3MNaAC混合物(20：1)沉淀PCR产物；6，5000rpm离心30分钟，去上清；7，75％乙醇脱盐；8，5000rpm离心10分钟，去上清；9，65℃干燥10分钟；10，加上样Bufferloul，溶解PCR产物；11，85℃浓缩PCR产物至5ul；12，Licor4300分析仪凝胶预电泳半小时，上样1．5ul，电泳约3小时；13，利用软件Gelbuddy分析基因型结果。2．2．2．3SNP芯片分析IlluminaMaizeSNP50chip(http：／／www．illumina．com／products／maize_snp50_whole_genome_genotyping_kits．ilmn)用来进行基因型的分析。根据B73参考序列设计SNP探针，MaizeSNP50基因芯片共包括了56110个有效的SNP探针，经过30个多样性的玉米自交系的测试，20 华中农业大学2012届博士研究生学位论文结果显示这组探针具有良好的检出效果。而且这张芯片具有每Mb大于25个标记的平均密度，即每40kb就有一个标记，绝大部分的标记间距在50kb以下，从探针的覆盖度和分布情况判定该探针组基本胜任全基因组关联分析的要求。针对144份自交系群体利用Illumina公司的MaizeSNP50Kits在怡美通德有限公司完成了杂交和检测试验，得到了SNP鉴定的初步结果。根据Genomestudio软件的使用说明对SNP鉴定的初步结果进行了手工的调整，将杂合型的SNP位点作为缺失处理(Yan，eta1．，2010)。总共有45868个SNP位点具有最小等位基因频率在0．05以上并且缺失数据少于20％，这些SNP被用于后续的关联分析。2．2．3．统计分析2．2．3．1表型数据分析SAS8．02(SASInstitute，2002)PROCMIXED程序利用BLUP的方法用来计算每个自交系每个性状的校正平均值，并利用两次(96份自交系、2007年)、三次(144份自交系、2009年)表型试验的结果进行基因型，环境以及基因型和环境互作的方差分析。两个条件下的每一性状都利用下面的公式进行了广义遗传力的计算：h2=62G／[82G+(62GE／n)+62c／m]其中62G是基因型变异，62GE是基因型与环境互作变异，62。是随机误差，n和r分别代表环境数和重复数(KnappSJ，etal．，1985)。方差分析的数据是两次(96份自交系、2007年)、三次(144份自交系、2009年)试验的结合在一起进行。两次(96份自交系、2007年)、三次(144份自交系、2009年)试验中每次重复每个基因型至少15个植株的平均值利用PROCGLM来评价基因型和环境互作(GXE)以及基因型和水分差异(GXT)的互作。两次(96份自交系、2007年)、三次(144份自交系、2009年)试验下综合的9个表型的皮尔森相关性用PROCCORR完成。各个性状通过了Shpiro．Wilk检测来判断正态分布。两种水分条件下的各个性状三次(144份自交系、2009年)试验的校正平均数用来进行GWAS分析。单一环境的高代回交群体的QTL分析利用了IciMappin93．0软件的完备区间作图的方法，利用三次重复的算术平均数带入作为各个性状的表型值(Li，eta1．，2007)。确定QTL的对数似然值为2．5，所有QTL的步移速度都为lcM。2．3．3．2全基因组关联分析STRUCTURE应用贝耶斯马尔可夫链蒙特卡洛原理评价了群体结构 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位(Pritchard，eta1．，2000；Evanno，eta1．，2005)，并根据杨小红等的方法将自交系分配到不同的亚群(Yang，eta1．，20LO)。利用Powermarker3．25计算得到Nei’S遗传距离和NJ进化树(Lhi，eta1．，2005)。选择MAF小于0．05且缺失少于10％的SNP位点28791个进行主成份分析(Liu，eta1．，2005；Price，eta1．，2006)。NTSYSpc2．1里应用DCENTER和EIGEN模块以Nei‘S遗传距离为输入值得到PCA的特征向量。考虑到自交系之间的血缘关系，选择了Genomestudio系统评分更高的9905个SNP(seperationvalueisbiggerthan0．6)位点应用SPAGeDi软件计算得到了144份自交系两两之间的血缘关系(Hardy,eta1．，2002)。利用Haploview3．31(BarreR，eta1．，2005)得到基于45868个SNP信息计算得到的成对LD评估的r2值，参考严建兵等(Yan，eta1．，2009)的方法计算LD衰减的距离，SNP的位置信息参考AGVP一1，序列和功能预测来自MaizeGDB。为了减少假阳性，16种模型被用作比较、鉴定、选择最佳的关联分析模型。前6种模型分别是：GLM，GLM+Q，GLM+PCA，MLM(K)，MLM(K+Q)，MLM(K十PCA)。另外10个模型是MLM(K+PCA)，并且每一次加入前10个主成份中的一个。每个ShIP都被作为固定效应去检测ShIP与性状的关联。所有模型的关联分析都由Tassel3．0．50完成(Yu，eta1．，2006；Zhang，eta1．，2010)。考虑到SNP之间的非独立性和染色体的独立性，三种阈值被用来分析了关联分析的结果，分别是-log(10／45868)，-log(1／45868)和-log(O．1／45868)。曼哈顿图和QQ图都由I也．12．0完成(gplotlibrary)。3．结果3．1．群体构成和特点3．1．196份自交系群体群体构成和特点对96份自交系利用全基因组范围的71个SSRs的信息通过STRUCTURE软件进行分析的结果：根据软件给定的出现峰值处的判断依据来看，没有明显的群体个数(图1)。根据△k的判断方法，从图1的结果可以看到，当分群从3个变成4个时，似然值变化较从2个到3个要小。这与育种的实践的便利性吻合，育种上一般会分成两个群进行杂交，这样就会出现分成2个群的模式，但是由于刁i同的育种单位之间的认识会有差异，会出现中间群的情况，所以从杂种优势群来看，3个左右比较合理，即两边加混合的模型。同时，注意到结构的划分，一是为了解材料的构成，另外还为了控制关联分析中出现假阳性， 华中农业大学2012届博士研究生学位论文提供一个合适的参数，在群体数目不足一百时，分类过细会减少每个群的数目，进而出现个别亚群会出现不足群体总数5％的情况。如果按照80％的成分属于某一类的标准(图2)，我们发现绝大多数的材料，是没有明确的群体划分的。正是由于这个原因导致无论划分为多少个类群都不能有更清晰的结果。图1基于多次重复的LnP(D)图Fig．1PlotoftheLnprobabilityofdata，LnP(D)，averagedoverthereplicates图296份自交系的群体结构。每个自交系用一个垂直线表示，它被分成3种不同颜色表示分成3个群，每种颜色所示高度即分到该群的比例。Fig．2Estimatedpopulationstructureofthediverseinbredmaizelinesinthestudy．Eachofthe96individualsisrepresentedbyathinverticalline，whichispartitionedintokcoloredsegmentsthatrepresenttheindividualestimatedmembershiptothekclusters．3．1．2144份自交系群体群体构成和特点基因型数据在144自交系分析的基因型数据中，IlluminaMaizeSNP50BeadChip中有81．75％(45868／56110)的SNP达到了MAF大于O．05，同时缺失数据在20％以下。根据SNP所在寡聚核苷酸的序列与AGPVl(http：／／www．maizesequence．org)∞加∞，0O0 华中农业大学2012届博士研究生学位论文3毒蔷毒薅S$$霉辜毒$审蒂霉亨爹擎爹爹霉霉毋霉譬’distancebetween咻oSNPs图4所有10条染色体的LD衰减速率图数据通过45868个最小等位基因频率不小于5％的SNPs信息评估得到。不同颜色代表了不同的染色体，具体对应关系见图右侧。横轴为成对SNPs之间的距离，纵轴为成对SNPs之间的相关系数。Fig．4LDdecayrateacrossthemaize10chromosomesmeasuredusing45868SNPswithaminorallelefrequency(MAF)greaterthan0．05wasshown．25 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位群体结构和血缘关系玉米材料的群体结构是全基因组关联分析的主要挑战，它是造成假阳性关联的主要原因。但是考虑群体结构之后进行全基因组关联分析能够避免假阳性。因此，本研究选择高质量的28791个SNP(MAF>5％，missing<20％)利用STRUCTURE软件评价了群体结构，创建了将各个自交系分配到各个亚群的Q矩阵。根据已知的系谱和△k(数据未展示)，144份自交系材料的玉米集群被分配到3个亚群。考虑到STURCTURE软件计算量巨大，而主成份分析(PCA)又是一个被广泛用来评价群体结构的方法，它通过建立一个P矩阵去完成群体的校正从而去掉由于品系之间的交融而带来的分成效应(Price，eta1．，2006)，它是一种有效的评价群体结构的替代策略(Zhao，eta1．，2007)。在主成分分析中，通过由SNP分析产生的前两个特征向量能够包含较多的遗传信息量，进而推测可以划分为三个亚群(数据未展示)。基于Nei’S遗传距离建立的聚类树(NJ)暗示与STURCTURE和PCA分析类似的结果：这些材料可以分为3个亚群(图5)。血缘关系系数的分布显示，关系系数在0到O．45之间的比例占到了97．6％(图6)。总共有62．9％的关系系数等于0，这暗示自交系之间没有血缘关系，图6显示，随着分位数的增加，血缘关系系数值连续下降。血缘关系分析表明只有极少数品系之间有较高的相似度，进一步表明这些自交系组成的群体适合用于全基因组关联分析。 华中农业大学2012届博士研究生学位论文图5144份自交系聚类图三个不同颜色的扇形表示不同的类群。外周相同颜色表示的材料代号示意相对的距离较近的材料。Fig．5Neighbor-jointtreein144maizelinesFan．shapedwithdifferentcolorsshowdifferentclusters．Codeswiththesamecolormeanthecloseddistance．27 华中农业大学2012届博士研究生学位论文涝渍胁迫对叶片的MDA含量在品种之间有明显的影响(P=0．0002)(表1)，而且环境和品种间的互作也达到显著水平。MDA水平显示在渍水后有一半材料(15)上升，一半材料下降。从平均值来看略有上升。根据邱法展(2007)的报道在第4天耐渍自交系下降达到最大，敏感自交系上升，判断这个时机可能是不同自交系差异最大的时机，选择为取样时间。从结果来看，说明确实在这个时间点上，材料之间出现了不同的表现，可以通过这一性状间接判断材料的耐渍能力的强弱。与此同时，在这个时间取样，叶片中MDA变化不是很显著，即出现了在渍水与正常水分下环境效应没有达到显著差异，这一趋势与邱法展(2007)的报道是一致的。而有的上升有的下降导致品种与环境的互作效应达到显著。表1MOA方差分析表Table1MDAANoVA’代表p<0．05，木幸代表p<0．01，”+代表p<0．001，ns代表不显著品种指代96份自交系：环境指代渍水处理和正常水分‘’‘’·’+’at0．05．0．01and0．001significantlevel；asmeansnotsignificantAccessionmeans96inbredlines，environemtsstandsforwaterloggingandnormalcondition．表2MDA描述统计表Table2ThedescriptionstatisticsofMDA根据邱法展(2007)的报道渍水4天以后，耐渍自交系POD含量持平，敏感自交系POD含量上升到最大，推测这个时间点取样可能是不同自交系差异最大的时候，故选择的取样时间。表4显示在绝大部分的材料里POD水平(34) 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位上升，少数材料(4)POD下降。这样的结果预示着大多数材料的POD水平在这一阶段还是处于上升的阶段，倾向于渍水敏感。POD的方差分析显示：该性状在品种间达到显著差异(p<0．01)，环境影响(渍水与正常条件)达到显著差异，品种与环境互作不显著。相关分析表明POD与MDA负相关(-0．29)，没有达到显著水平。表3POD方差分析表Table3PODANoVA‘代表p<0．05，，|奉代表p<0．01，”+代表p<0．001，ns代表不显著品种指代96份自交系；环境指代渍水处理和正常水分‘·‘+·’‘‘at0．05．0．01and0．001significantlevel；asmeansnotsignificantAccessionmeans96inbredlines，environemtsstandsforwaterloggingandnormalcondition．表4POD描述统计表Table4ThedescriptionstatisticsofPODP。。正鬻复1渍精复1渍糯复23．2．1．2生物量性状的表型分析表型分析结果显示，所有性状都呈现连续单峰分布，属于数量性状适合后续的定位分析。描述统计表明，正常水分和渍水环境之间所有性状表型变异的程度明显。大多数性状在EXE2中表现出最小的均值，在EXE1中出现最大的均值(表5)。总体来看，两次试验都表现为渍水下的性状表型值显著小于对照条件下的表型值(17-54％的下降)。大体上，RL，RFW，RDW在渍水处理下下降的更多。也就是渍水的影响对根部的影响比茎部性状要大。方差分析显示30 华中农业大学2012届博士研究生学位论文两次试验的所有性状均值在渍水与正常条件下表现出显著差异，所有性状都存在显著地GxE和GxT互作，除了RL和TL以外。广义遗传力结合了两次试验的不同水分环境的数据计算得到。结果显示，九个性状的遗传力基本差异不大，都在0．6．0．7之间变化。表596份自交系群体两次试验在两个水份条件下苗期性状的均值，标准差，和广义遗传力Table5Meanvalues，standarddeviations，andbroadsenseheritabflity∞ofseedlingtraitsobservedunderdifferentmoistureregimesinthetwoexperimentsSH(cm)RL(cm)TL(cm)SFW(g)RFW(g)TFW(g)SDW(g)RDW(g)TDW(g)21．88士2．96¨+16．08士3．08”+16．49士3．49“+12。60士4．41”+37．99士5．42⋯28．59士6．59”’1．67士0．50¨+0．87士O．61．”1．07士O．36”’O．59士0．3l”+2．72士0．80¨+1．45士0．73”+O．20士O．06”+0．11士0．13”+0．11士0．04”+O．06土0．09”+0．31士0．09”+0．17士O．22”’27．53士4．0020．04士4．630．6532．05士5．1319．29士6．600．7059．44士8．5539．60-J：10．13O．662．42士0．911．44士0．62O．622．34士1．061．02士0．420．724．75土1．922．2l士1．08O．660．24土0．090．14士0．060．630．20士0．100．09土0．040．630．43士0．180．23士0．10O．62广义遗传力flt公式h2=62G／[62G+(62GE／n)+62。／rn]tl-算，其中62G为基因型方差的估计、62。为环境方差的估计。n为重复次数，62G和62。来源于方差分析的期望均方。aSH，苗高：RL，根长；TL，总长；SFW，茎鲜重；RFw，根鲜重；TFw，总鲜重；SDW，茎干重；RDW，根干重：TDW，总干重。b在2007年8月(EXP．2)、9B(EXP．1)两次试验的每个性状测量的结果。c在这个关联分析材料里渍水处理和正常条件下性状平均值之间差异显著的统计测验。d是在渍水处理和正常条件下苗期性状的广义遗传力(h2)。G×E和G×T分别代表了基因型受环境的互作效应和基因型受处理的互作效应，”，”+分别代表显著水平在p<0．01并Hp<0．001。8SH，seedlingheight；RL，rootlength；TL，totallenIgth；SFW：shootfleshweight；RFW：rootfreshweight；TF彤totalfreshweight；SDW,shootdryweight；RDW,rootdryweight；TDW,totaldryweight．3l¨峪岱¨～i兮璐～一～¨～ 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位oThreetimespotexperiments(1and2)inwhicheachtraitwasmeasuredwereconductedinAugust(EXP．2)andSeptember(EXEI)in2007，respectively．。Statisticalsignificanceofmeancomparisonsbetweenthewaterloggingtreatmentandcontrolinthismaizepanel．oBroadsenseheritability(h2)ofseedlingtraitscombiningthewaterloggingtreatmentandcontrolcondition．Theinteractioneffectsofgenotypebyenvironment(GxE)andgenotypebytreatment(G×T)areindicated．¨，幸·}indicatesignificanceatPSO．01andPS0．001，respectively．相关分析表明，除了渍水处理下SFW与RDW之间外，在渍水和正常水分条件下，同属性性状之间都达到了显著相关(p<0．01)(表6)。正常条件所有的性状都达到了显著地相关，渍水处理下长度性状与干重性状之间没有显著相关(p0．01，蓝色为0．01>p>0．001，绿色为0．001>p>0．0001，红色为p<0．0001。Fig．9Linkagedisequilibrium(LD)patternswithinzmbP,LZin96maizeinbredsgenotypedwith10SNPs．Thesquaredcorrelationcoefficients(一)foreachpairofmarkersarepresentedintheuppertriangleandtheircorrespondingtestsinthelowertriangle：whitep>0．01，blue0．01>p>0．001，green0．001>p>0．0001andredp2．5)，其表型贡献率在3．91％-．13．52％之间。其中13个QTL位点集中分布于umcll71(5．04)．bnl92305(5．07)，4个分布于5．00bin的区域，并且，除了一个苗高相关QTL分布于5．06．5．07bin外，其余均为重量相关QTL，且集中分布于5．00bin和5．04．5．06bin(两个显著关联位点SNP4784和SNP2262位于该区间；见表13)。从不同的生长环境来看，渍水处理下共定位到8个QTL，正常条件有9个。第9染色体共定位到4个性状的5个QTL，且全部为重量相关QTL，集中分布于9．00bin和9．06-．bin9．07(显著关联位点SNP200位于该区间；见表13)。从不同的生长环境来看，渍水处理下共定位到3个QTL，正常条件有2个，表型贡献率介于4．99％和10．78％之间。在所有QTL中，苗高相关QTL有1个，地上部分鲜重相关QTL2个，地下部分鲜重QTL5个，总鲜重QTL4个，地上部分干重QTL3个，地下部分干重QTL4个，总干重QTL3个。所有22个QTL位点中，表现为部分显性遗传的有13个，超显性遗传的有9个。加性增效效应来自HZ32的共有7个。TDW，TFW，RDW，RFW，SDW和SFW表型确定的QTL位于第5染色体bnl9653和phi87(309．．493cM)根据IBM2玉米遗传图(—httD：／／www．maize—2db．or—map．uhD)，它们涵盖了关联作图中发现的上述性状显著关联的SNP4784部分重叠。在渍水和正常水分条件下都得到了一致的结果。每个QTL解释的表型变异在5．64．13．52％之间。在两侧标记为bnl9653／plhi087的QTL起增效作用的等位基因来自渍水敏感亲本K12。但是不能肯定在第5染色体的主效位点是否一因多效，或者是与渍水耐性基因紧密连锁。正常条件下两个QTL分别控制RDW和TDW以及渍水处理下一个QTL控制TFW在BC2F2：3家系定位在第9染色体bnl91525和umcl714标记处，该位点涵盖了关联位点SNP200。单独的QTL可以解释的表型变异为4．99．7．97％，来自渍水耐性的亲本HZ32提供增效等位基因。在第6染色体上鉴定的关联分析主峰在这次连锁定位中没有找到，但是邱法展等(2007)报道了在F2群体中定位到一个渍水处理下控制RDW的QTL位于6．04bin。从以上结果，我们推断关联分析和连锁分析得到的3个主要QTLs是真实的渍水耐性基因位点。 ∞寸QoQQoQ山Q厶Q山QoQ山QQ山口山Q山Qo寸No．0寸10．0卜心o．0oHo．o．N∞o．0．均卜冀。岔No．0．∞协o．o∞_o．0．岔寸o．0．岔oo．0．婚No．o．寸oo．0．￡oo．0^寸oo．o。noo．0。∞no．0．崎Ho．0．∞N冀o。AHH．0．n吣N．o。卜oo．0_【oo．0n∞o．0寸oo．0．△no．0。Nnoo．Nn—o．卜nN．0．小卜o．0。∞oo．o。_∞o．o．n_o．0．N=．0．帆oo．0．∞oo_0．nNo．0．oHo．0。HoH．0．noo．on=．o寸∞o-0”∞o．0卜Q—n0帆仓昏寸∞■oHn∞．9Nc．婚nc．△磊一寸∞．8卜厶．oH—o．N一'【H式_【寸蛤“NN‘寸∞．6N价．￡_o寸．6价心．IHH西I￡∞c．卜寸卜．寸寸心．9o小寸卜岔．乙n婚式心ao寸啦．cNo．c一寸．寸N∞寸nN“n■no●∞N￡．口HN．c价n．n寸寸呐a∞一Ntnn冀卜-【”“小冀寸∞∞式N寸n^卜o．昏。寸一卜一o—IItl^卜o．⑦_)寸一卜一o—IItl^卜o．Q_)寸一卜一o—lI暑^oo．6i∞∞Hogtl^oo．6i∞∞．【o吕j一卜。．n一价。nN∞一口D一∞。．n一卜∞o一矗厶一∞o．帆一卜∞o—lA一∞o．n一卜∞o一工A^no“vNN卜_【ogtl^呐。．n—NN卜一o—葛11^”o试一NN卜_【u吕j^”。“一NN卜'【。暑3一n。．”一NN卜一o—IIj^no．价一NN卜'【o耋^寸。试一_卜=ogj一寸o．n一一卜一一o—口；^寸o“一_卜H．【o基11一。。“v∞。。H暑llI声一。。“v∞。。H暑I盎声一o。“v∞。oH磐盘声^oo“一∞ooH∞一II声一岭o．6vnN”H暑I口。一∞。．6vnN价H暑I口声一∞o．6一价NnH暑Ia皿一。。．△vN卜N一∞一口D—o。．吼一N卜N一∞一aD一心o．价一卜∞。一I{厶^no试vNN卜Ho巨Tl^no“胃N卜HoIuj—no“)乙N￡u吕j^寸o．Sv_卜=。吕j守。“一_￡H。g；一寸。“一H卜-【H。骞t1一寸。“vH卜H_ugo一寸o“vH卜H石旨j拿o“v；__ogj一寸。“一nn蛤磐II声一寸。试一nn心暑Iap一寸。“一n”吣∞一IIp^oo“-∞H=o雹j—o。“v心H寸H。gj—o。“一心寻H。g；^oo试一∞_寸H。gtl卜o．6．田o．6＼嗲Q—U叮卜o．6-90．6、嗲9HU口卜o．6。∞o．6|／嗲函卜卜叮oo．6≥．9H卜口oo．6≥，臣卜口卜o．价．田o．价}i∽h口℃o“．no“≥山配U口∞o试。no“＼嗲‰卜U口∞o“晶。试k嗲瞳∞卜口帆o．”．寸o．nk哆盆U口价o“毒o“．f嗲也盈卜叮价o“。寸o“＼嗲Q卜卜叮no．n．寸o．nk_A皿h．工叮no试寻o“＼嗲Q配卜口价o“．寸o．呐≥．口∞■叮寸o“k哆Q卜U叮寸o“．，嗲Q∽U口寸o．”k嗲山∽U口oo．S≥．Q∞U口oo．m＼声皿一U口oo“k哆也盈b口oo“＼嗲也1笛U口．／多Q—U≥Q醋Uk嗲‰卜h≥Q幺卜≥也盈卜}{∽■≥＆U瓮r皿HUJ，嗲山∽H≥Q酲U≥臣卜≥Q卜b、莎‰h■≥Q醋卜≥b∽■|／嗲QhUk嗲Q∽U≥‰∽U≥Q∽Uk莎‰一o≥也盈b≥臣UoA—_Q《^摹。aA山Qo一(u—q)Ja)I≈窆盖砭(u—D)Jo嵩至粥o，Ido吕对Z，I卜o∞兰舀卜Q口-口∞o警50立叻∞眯姆一一ao．Iu矗—葺o．I一口oAI．Io口嫂攀墨葵魈雅棚醛畏≥研oⅡIIc“函NU笛o∞一-o盘。墨叠昌Ao盘爵uI弓。艺。艺电叻皇矗皇芎。矗∞它口食苫o．I．IoJ一一ooAI瓮苫厶岍QIq矗一逍披窆一u一瞬憾七o∞一《n“囔u笛双张N一)I恃伥镣蟮繁烬冥N￡Z雹将枨魈筐繁璐=僻掣坡颦卿g一■d烬窿暴粗*悄 ．霄aJ四鼍苗警艺_儡扫譬帛qo∞皇。曩'ooIJo薏go专菪o∞2厶aJ矗p鼍∞80目TllIolI一．no一嘎一启絮∞Il9so专∞对．∞岩暑-o∞IIo一瓮IA2p嘎茗o∞2Q2o它I：R一事oH'【0J∞8#Q—ol：【一．奎oAI_8dS2^u一'【p口IIoQ它l：爵一一一菪。目苗D扫∞羞∞∞o—J9苗事∞I：爵。吕u．Io‘L-3苗一IB岩导D苗皇。专．厂I卜a．10J∞_H8∞aJAaJ寸6d磊Z一卜∥lIH时o专苗暑罟oIp眉∞芑盘奄QAI苗∞oZ．_胃扫。若-ooIlIB≯Q专∞o∞对20葺。一。一焉NnN茁Q专苗暑卫8Ip眉∞芑m硝oQ≯暑∞o山．8a爵lI一蜀opJo>o．Qo‘90磊眉go它一恩p舄盆．Q厶oDmH奄oo磊暑IIIo它．Qoo醴ooAl岩屯pB，《．嵩＆一一ao专苗∞∞对一oo受芑lID∞o专占p9II蔓dxo8趸焉>oId备。皇。暑。专Joo管_83J出．价o_【景P曩焉∞暑o∞o专旦IBo召8pI鳖'sg嘎lA2p景专J工．一u一．【曼lIoQ它lIB一巳_8是罟∞lIl8∞o—J9苗事眉对苗它。H受芑8暑∞_8∞aJA2矗蔷一墨一dBo荟《o专．∞Q蜀詈∞岩墨黾Jo函删迫S骝冀蕃窿鼙凶趟删葵赳蹙憔悄仆籁g妪球卉懈喂捶婶葚球．泖坦捶郇g葵草婶惜懈廿仆窭呈fNu罢卜．芒礤粘H罢尉议*燎憔懈舔求。督h廿*泖K七1拣．1_a懈≮叮．廿。是Z_一9矗。NH譬皿长困醐趔如较磐憔搽趔斌。NnzH皿长困蛾掣凇狡磐憔群趔茸。魈叫靶．Qo一掣嗡求箍．Qd‘趟较世嚼．Q一目校牡罴．《。斟丑g呔锹副僻g涎琏墨口粼求副困醐议迦磐一一9柑．叫>山。n僻匣盯坦g迥⋯_呈f仆婶。芒礤牡H惜懈o。眯姆go．n∞眉A导君。H皿长眯蟋迥Qo一．刚烈*烬憔僻一时扑盯K七1球仆娜葵掣忙逛仪刁拿迥扑州慑匿书蛙哩2()N扑K爿《仁b洱 言善异S兰墨i；P●■■·^一●r-H爵墨2寮箸窖：冀譬on．(_艺_uH一∞uI盘dl¨旨景AJu苫一。岩∞。盘暑。。3AIs薯弓葺一∞口Is暑一Nn闷lI弓d【BN一譬v∞u口II弓。．Io置一uN瓷昌。事_目8^f5u盆∞∞。b矗暑。J-，弓u盘。冒≯。弓∞。善暑B．，霜气u固o∞HJo∞口召∞馁口。u目。一葛In盘。盘N气U固食uI甙弓蛊爵心‘s∞。昌。∞。暑。．I弓口。∞-侵占弓害_26∞口。ds。．I∞置昏∞。lJ3磊≥．I盆rI一9。蛊_．10∞葺。召赢u。一。基。∞。昌。．I弓弓盎靠盘矗昌‰露IⅡ11m一．嚣互咪姆rI一∥则鉴q葚∞球岔冥∞．晌拣柑留葵犁辕州罂掣披窆H譬幡搽七。∞H芒盈龟u∞杈礤NH)I幡馓餐搭繁酶冥N￡Z雹幡帐魈萑繁媚晌H匝●■．E■，0C=q乞鼻¨一_■，_●^；．，=：1．苫‘．不=算c-一．。．，。。暑lj‘}¨S—1．‘ttorr。l_lt，2_-●_n●=●-o_，譬，■nr●，叶粤^，一¨，-一■迥似半删grI■了蝼萑踩粗*旧 华中农业大学2012届博士研究生学位论文3．4．候选基因预测通过连锁作图以及全基因组关联分析共同检测到的位点，第5染色体和第9染色体上的两个重要的QTL具有更加可靠的信息，自然成为后续研究的焦点，考虑到关联作图的精度，因此，研究中利用生物信息学预测了两个关联位点两侧LD衰减范围之内的候选基因的状况。在关联分析的群体里，由于在该群体里较慢的LD衰减带来的近200kb的衰减距离，候选基因显著关联(p<2．18×10币)SNP位点(SNP4784和SNP200)两侧共400kb的范围内预测。SNP4784位于基因G砌忆M2G012046内，该基因在第5染色体bin5．04，在400kb内预测到8个基因，功能注释展示在表15。这些基因涉及转录调节(Mitochodrialtranscriptionterminationfactor-related)、胁迫响应(Membraneattackcomplexcomponent／perforin／complementC9)、信号转导(WD40repeat-like，NTPpyrophosphohyrdrolaseMazC毛putativecatalyticcore)、翻译调节(RibosomalproteinS27)、能量代谢(2Fe．2Sferredoxin，iron—sulphurbindingsite)。physical一|+chromosomephysicalstartendantisense／sensenameannotationSNP200位于基因GRMZM2G009808内部，该基因在第9染色体bin9．07，在400kb内10个候选基因的功能注释展示在表16。这些基因涉及转录调控(GRMZM2G126817．regulationoftranscription)、活性氧物质生成和清除(GlutathioneS．transferase，C．terminal．1ike；glutathioneS—transferaseGST9)、蛋白降解(Cyclin．1ikeF．box)、次级代谢(甾醇合成，24．methylenesterolC．methyltransferase2)、能量代谢(Aconitase／3一isopropylmalatedehydrataselarge一8●一肌型帕仃一勇阳一溯|妻l铡庐一啪堕b山一蝴堂0b一吣喾lm释竺●l-口，_‰释型4哪一O．m一●●】_姗!量I体些色塑篓 玉米苗期耐渍QTL的遗传定位subunit)、信号传导(IQcalmodulin-bindingregion；ProteinManganese／magnesium)、胁迫响应(Antifreezeprotein，type(Outermitochondrialmembraneproteinporin)。phosphatase2C，I)和转运调节chromosomphysicalantisenseestartend／sensenameannotationchr9147333144147334649一GRMZM2G1268i7regulationoftranscriptionchr9147365493147366457+GRMZMeGl26802147369543147372282147380975147382413147384520147387734G】良MZM2G126763IQealmodulin-bindingregionGlutathioneS-tmnsfemse，C-terminal-likeglutathioneS-t]甚nsferaseGST9GRMZM2G126745Cyclin-likeF-box147392687147394566+GRMZM2G126682chr9147424502147432777chr9147476215147480444+GRMZM2G010017chr914763035424-methylenesterolC·methyltransferase2Aconitase／3-isopropylmalatedehydrataselargesubunitaspartatebindingsite147633349+GRMZM2G059891Antifreezeprotein，typeI，14763512l147638725+GRMZM2G059937Outermitaehondrialmembraneproteinporin4．讨论●4．1．衡量渍水影响的玉米苗期性状渍水处理的植株生长受到抑制，进而造成产量的下降，给农作物的生产带来了巨大的威胁(Rathore，1998)。玉米受到渍水的影响减产明显，因而对玉米的耐渍研究显得非常必要。作物遗传改良是一种非常有效的途径，发掘新的抗性资源是耐渍性育种改良的基础，本研究利用叶片枯黄程度的指标筛选了一些抗性较好的资源(HZ32、交5l、吉864、获唐黄、4F1、桂102、szvc4．34111等)(附录7)。其中HZ32和交51是被报道过的利用叶片枯黄程度来筛选的耐渍性较强的资源(邱法展，2007)。52的型墅Ⅻ一～型诫坚内硒一b射一蚰：霎l肽坐O器一4N—m释坚件=冉7．孤一肺!垂l吼；暑一体塑色钳一=9d一第型柳些O—O一2一P—N—S一6一二 华中农业大学2012届博士研究生学位论文叶片的健康程度是植株健康与否的重要表征，通过考察叶片枯黄的程度来度量植株在胁迫后的健康状态是一个值得去尝试的衡量指标。对不同基因型的玉米材料而言，渍水条件下叶片发黄的程度表现出很大的差异。邱法展(2007)利用叶片枯黄的程度和苗生长势可以将玉米的20个自交系明确地分成5个等级。Zaidi(2007)报道玉米叶片的退绿在不同品系间差异显著。已经图位克隆的水稻耐淹没基因SUBlA，初定位时也是采用了淹水后恢复几天后叶片保持绿色的程度(相反就是发黄的程度)作为耐淹鉴定的指标性状(Xu，eta1．，1996)。以上皆说明，利用叶片的枯黄程度来判断植株的健康程度是一个可靠的性状。本试验中，对144份自交系群体进行叶片发黄程度的鉴定，通过公式(见材料与方法)计算死叶指数，方差分析显示品系之间的差异显著性(p山ov)一E。召宣‰go皇U∞暑∞卜J∞=∞>II叫cu工山八毛一×∞一．Nvd)《迥誊水郴叫婚帐莲议秘迥扑划妖器书皱嘤NHoN扑K爿《哥抖 摹装蒜一Nn∞卜、口mn奏重||麓垂吞黼溺茎■詈霎一氢鬻一雏瓣盈瓣hooq．葛奄=一口卜—口oN．．．『≈1，∞jl|口^ooH．．龟≈=一口hooN．．毽≈拿一dhooN．．葛Jao—d^8N，飞奄11一dgoN．．，口Jaj10h8N，飞奄f1一d^8N．．龟≈；一dho。q飞≈=子hooq．飞≈t1一a^8H，龟≈j—a^o。N，奄≈jIbhooq．_『≈≈j—dhoo叶．龟≈j—d卜ooq．_『≈≈rI一口^ooq．龟≈；一d卜ooH．．～≈～～rIliu卜ooN，_『q≈j—ahooN．．龟≈j—dhooN，葛≈rI—d卜ooq．_『乜≈=一dhooq．飞≈rI—ahooN．．飞≈j一口卜凸6一，_『≈_，∞；—口r-E莹笆一r-E≥焉r-E≥置．r．E，晤”r．￡≥毫一r-￡≥焉r矗}譬一rIE}毛”f．m；毫一r-E，咕∞r．￡；pl—r．￡帆p”r-￡；嚣一r-￡言”r矗奎p1．r．￡毒∞f．m量鼍一r．￡毒∞l-m；薯一r-￡≥甾一．m；pI—r．￡毒”r-￡誊p1．r．￡}q”f．m；甚．r．E}譬m．ntl氩一r．nll4c-nl岛r^llAE-H盖一r曲l{4c-n苦．1．nll盘c-n苦．r．Nl盘m．ntt盈．一．一lt(王c．n置．r^tlAc．n盖．1．nl乱m．Nll厶一r．Nll4￡．H盖一r矗114呷H舌一r矗tlA￡-n置．f．ntlA寸o．n寸on寸on寸ono∞毛H×n口”T。一×一N乞_×Icn毛一×z10．_【毛_【×=．_【乞_【×m∞．”t。一×AN一毛_【×高．h，o_【×譬一毛一×∞叶一to_【×∞II，o一×小。．N，o_【×衾一，。一×一卜_【to一×∞西．一，。一×寸∞．一卜0_I×N。H乞一×Nn．t乞_×m。．aT。一×西n．一，。一ד卜一色_【×_【h．t，o一×n卜．一乞一×【9h色_【×跫．h∞甘n一乱∞小∞∞寸”N小∞小口卜NN∞∞口A蚺卜NH∞∞∞小n”aN寻口hn”mN_【寸寸卜non”西nn卜nonn小nn卜n小心一。价卜小卜小小一。价卜西卜tnnhcIahnn”n寸∞寸∞nn”nt，∞寸口”n”n口∞葛nnnn口∞葛nn”n寸∞寸心nnn”寸∞葛nn””寸∞寸吣nnnn寸∞寸岫它专管专n皇u吧二u墨二un．ILtu一心∞nno《N山一．∞岫nno