家蚕大规模EST测序及脂肪体基因表达谱分析

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1、西南农业大学硕士学位论文家蚕大规模EST测序及脂肪体基因表达谱分析姓名：程道军申请学位级别：硕士专业：特种经济动物饲养指导教师：夏庆友;鲁成2003.5.1家蚕大规模EST测序及脂肪体基因表达谱分析摘要表达序列标签(Expressedsequencetag，EST)是生物基因组中最有价值的基因结构信息。构建生物特定组织、器官或细胞的cDNA文库并进行大规模EST测序分析。能直接获得大量的功能基因结构及表达特征，并以此来构建各种组织器官的基因表达谱。家蚕是一种重要的经济昆虫，也是鳞翅目昆虫的模式生物。本研究选取了家蚕丝

2、腺、生殖腺、中肠、脂肪体、血液、卵(胚胎期)、卵巢培养细胞等12种不同发育阶段的重要组织器官。分别构建其cDNA文库，再对每个文库进行大规模EST测序分析，以期发现与家蚕性别调控、变态发生、胚胎发育、能量代谢和物质代谢等密切相关的功能基因．家蚕脂肪体担负着体内物质贮存、能量供给和中问代谢等重要生理功能，是典型的变态模式组织。因此．本文主要通过对脂肪体EST数据的分析，研究家蚕交态过程中脂肪体的基因表达情况，获得参与家蚕变态的功能基因群，以期从分子水平阐明家蚕变态发生的作用机制．／一f1、家蚕cDNA文库的构建’提取高

3、质量的12种家蚕组织器官的总RNA和mRNA，合成带有EcoRI和XhoI粘性突出末端的双链eDNA片段；电泳回收500bp的eDNA片段。定向克隆入pBlueseriptIISK(+)质粒载体。将重组质粒转入受体菌BBl01中。得到实验所需的cDNA文库。文库重组率平坷为93％，原始库容平均为1．23×105克隆／m1，外源插入eDNA片段的大小平均在400—1500bp之间．表明文库质量较高。2、家蚕大规模EST测序对家蚕12个组织的eDNA文库进行大规模EST测序。通过去除载体序列、重复序列以及细菌DNA序列等

4、处理，共获得81625条有效的F．ST序列，序列长度集中在250～550bp之闻．对EST序列进行聚类分析和拼接，共获得24678个UniGene(非重复序列)。其中包括11627个contig(重叠序列)，13051条singletons(独立F．ST)．contig序列大小集中在200～1200bp之问，由此推测．家蚕中决定蛋白质编码的mRNA长度大部分为1200bp以下．家蚕EST序列同源性分析的参数标准为：blastx为E≤E一15，^1ignmnt≥3嘿；blastn为E≤E-IO，A1ignment>12

5、5％。同源性分析共检索到有7944个UniGene同已知基因数据同源，其中(i)同源且有功能注释的功能已知基因有3899个UniGene、共计32605条EST；(2)有同源但无功能IV注释的己知序列有4045个UniGene、共计16087个EST；(3)新的序列有16734个UniGene、共计32933个EST．家蚕功能已知基因EST数据除了部分与GeneBank中家蚕基因数据同源外，还与果蝇、烟草天蛾、人、小鼠、按蚊等’26个物种的登录基因同源：同时发现了许多参与家蚕性别决定和生长发育调控的重要功能基因，以及

6、与细胞分化、信号传导、组织发生等密切相关的功能基因信息．3、家蚕脂肪体基因表达谱分析3．1脂肪体基因表达概况家蚕脂肪体cDNA文库测得19030条EST序列，聚类分析获得6337个UniGene。其中包括4262个contig、2075个独立F．ST．同源性分析发现：(1)功能已知的UniGene有1226个，包括1196个contig、30条singletons，共计9264条EST，这些UniGene共注释为502个基因。(2)已知序列的UniGene有1341个．包括1030个contig、309条single

7、tons，共计2871条EST．(3)、新的UniGene序列有3770个，共计6895条EST．502个注释基因中，高丰度基因有117个，包括8179条EST序列；中丰度基因有234个，共包括933条EST序列；低丰度基因有151个．脂肪体所有己知基因在分子细胞生物学水平上大致可分为细胞骨架蛋白、胞外基质、激素与激素调节、信号转导与细胞调节、膜相关蛋白、转录翻译调节、能量代谢、物质代谢等八类基因．3．2脂肪体已知基因的表达差异分析表明，幼虫期脂肪体表达较多的是与物质代谢、转录翻译调节、信号转导调节、能量代谢相关的基

8、因；蛹期则是与物质代谢、细胞骨架蛋白、转录翻译调节、膜相关蛋白等相关的基因表达较多．幼虫期和蛹期脂肪体的基因表达表现出发育阶段上的差异．八类基因中，细胞骨架、胞外基质、信号转导与细胞调节因子、转录翻译调节、能量代谢和物质代谢等六类基因在不同发育时期的表达存在显著差异，差异可信性大于0．999，激素与激素调节以及膜相关蛋自质的表达差异可信性低于0