过表达Gnb2l1基因对体外节律基因mPer1表达的影响

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1、过表达Gnb2l1基因对体外节律基因mPer1表达的影响作者：朱雨邹晏江舟汪宇辉刘延友王正荣【摘要】目的：评价过表达Gnb2l1基因对节律基因mPer1表达的影响。方法：用PMA刺激NIH3T3细胞，使节律基因稳定表达后，用脂质体介导方法将质粒pcDNA3.1/Gnb2l1转染至NIH3T3细胞，并以空载体质粒pcDNA3.1/vector为对照。利用RTPCR技术检测不同时间点Gnb2l1mPer1在NIH3T3细胞中的表达水平，研究过表达Gnb2l1基因对mPer1基因表达的影响。结果：采用RTPCR技术显示成功转染，

2、实验组比对照组的Gnb2l1表达量明显增高(p<0.05)。并且发现实验组的mPer1表达量比对照组明显增高，但是经过余弦分析发现两组相比mPer1的表达周期无明显改变。结论：成功过表达Gnb2l1基因使节律基因mPer1表达量增加，中值增高(p=0.038)。【关键词】时间生物学;节律基因;Gnb2l1基因;per1基因;转染生物体普遍存在调控生命活动约为249h的近日节律[1]。mPer1为近日节律振荡器的核心组件，mPer1转录产物的磷酸化和入核在近日节律的产生和调控中起重要作用。Period1(PER1)是近日节

3、律系统中的核心蛋白,并且与机体其他功能诸如药物依赖、肿瘤发生等[2-3]密切相关。Gnb2l1是一个看家基因，在细胞接受刺激的时候，Gnb2l1基因能够迅速作出反应，编码合成RACK1蛋白，实现基因的转录调控以及转录后水平调控，并进一步引发一系列迟发反应。前期研究表明RACK1蛋白为PER1相互作用的节律相关蛋白，上调及下调PER1基因并未影响RACK1的基因转录和蛋白表达[4]。因此推测RACK1并非PER1的下游钟控蛋白，RACK1可能通过参与/介导PER1相关的信号分子通路，进而影响PER1节律及其他功能的实现。因此本文

4、研究过表达Gnb2l1发现mPer1表达量明显增高，可以推测Gnb2l1可能是mPer1的上游钟控基因。进一步揭示生物节律信号通路的分子机制、研究RACK1与PER1的功能联系提供了基础。　　1材料与方法　　1.1细胞株NIH3T3细胞由华西医学中心微生物教研室馈赠。　　1.2试剂DMEM培养基(Hyclone)，小牛血清(Hyclone)，青霉素(华北制药厂)，链霉素(华北制药厂)，胰蛋白酶(宝信生物公司)，PMA(phorboll2myristate13acetate，Promega)，Trizol(Invitroge

5、n)，RTPCR一步法试剂盒(Takara)，TaqDNApolymerase(Tiangen)，Lipofectamine2000(Invitrogen)，质粒抽提试剂盒(GIAGENE)。　　1.3细胞培养及诱导细胞于含10%小牛血清、100U·9ml-1青霉素及100U·ml-1链霉素的DMEM培养基中，5%CO2孵箱内37℃静置培养。NIH3T3细胞按每孔2×105个细胞接种于十二孔板，待细胞12h贴壁后，更换新鲜培养基(每孔1.98ml)，每孔加PMA20μl，终浓度为100nm·L-1。　　1.4转染PMA刺激2

6、4h后，按照脂质体LipofectamineTX2000说明书，将pCDNA3.1/Gnb2l1质粒转染NIH3T3细胞(A组)，以pCDNA3.1/vector质粒转染细胞为对照(B组)。转染12h后，每隔2h分别收集实验组和对照组细胞各3孔，共收集48h，24个时间点。　　1.5RTPCR检测Gnb2l1，mPer1的表达Trizol法提取细胞总RNA，采用半定量RTPCR法特异性扩增Gnb2l1和mPer1mRNA，分别与内参积分光密度(OD)值相比来分析Gnb2l1和mPer1mRNA相对表达水平。引物由Invit

7、rogen公司合成，序列见表1。　　1.6统计分析实验结果以(x±s)表示。采用T检验进行比较，以P<0.05为差异具有统计学意义。　　2结果　　2.1过表达效率的鉴定9　　RTPCR产物电泳结果见图1。用GelProAnalyzer软件，分析Gnb2l1及βactin，经RTPCR所得条带的(OD)值，计算Rtime=ODGnb2l1/ODβactin，如图2所示。图中可以看出实验组的Gnb2l1表达量比对照组明显增高(p<0.05)。表1引物序列　　　　2.2RTPCR测定过表达Gnb2l1基因

8、对节律基因mPer1表达的影响　　过表达Gnb2l1基因转染后可导致节律基因mPer1表达显著性增高(见图3，图4)。图中可以看出ZT8，ZT11和ZT12的作用更显著，其余的时间点普遍A组比B组高。　　图3mPer1电泳图图4mPer1mRNAs表达　　2.3余弦法分析mP