多环芳烃菲对微生物生态毒理研究、菲降解菌的分离鉴定及降解基因克隆与表达

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1、浙江大学博士学位论文多环芳烃菲对微生物生态毒理研究、菲降解菌的分离鉴定及降解基因克隆与表达姓名：夏颖申请学位级别：博士专业：微生物学指导教师：闵航20040501多环芳烃菲对微生物生态毒理研究、菲降解菌的分离鉴定及降解基因克隆与表达中文摘要多环芳烃(Polycyclicaromatichydrocarbon，队Hs)在环境中分布广泛，极易在环境中累积并可通过食物链传递，对人类健康和生态环境具有很大危害性。菲囡具有独特的化学结构，成为队Hs研究中的模式化合物，菲污染的研究不仅有利于污染环境中菲的去除，还可为其它PAHs污

2、染的防治提供有价值的资料。本文全面探讨了菲污染对淹水稻田土壤的微生物生态毒性效应并分离到两株菲降解细菌，对其进行了鉴定以及系统发育研究，同时进行了降解特性和降解基因克隆及表达方面的研究，为建立有效的菲污染预警指标体系和菲降解微生物的有效利用提供有益的参考。本研究所获主要结论如下：l、以杭州临平镇附近农田水稻土为材料，采用室内培养方法系统研究了不同程度的菲污染对淹水稻田土壤可培养微生物种群以及酶活性动态变化过程的影响。研究结果表明，不同浓度的菲对好氧细菌的生长和脲酶都具有刺激作用。并且刺激作用随菲浓度的升高而有所加强；不

3、同浓度的菲对真菌和脱氢酶则在整个培养过程中都具有毒性作用，特别在高浓度菲处理土样中，这一表现更为明显；各浓度的菲都对放线菌、厌氧固氮菌和产甲烷细菌具有急性毒性效应，并且100mg，l(g干土的浓度一直表现出对放线菌的毒性效应。在传统微生物污染生态研究基础上，运用PcR．DGGE方法，对菲污染条件下稻田土壤真细菌种群的基因多样性进行了初步研究。通过对菲处理后的淹水稻田土壤的DOGE图谱和多样性指数分析，发现各处理间的土壤微生物多样性出现了一定的差异，并且菲浓度越高与对照土样的多样性指数相似性越低。2、从石油污染土壤中筛选

4、分离到2株菲降解菌株，分别命名为zx4和E、，A17菌株。通过细菌形态学观察，生理生化测试，碳源利用实验(Bjolog)，G+Cm01％含量分析，全细胞脂肪酸分析以及16srDNA和ITs序列同源性分析，证明两株菲降解细菌应属于鞘氨醇单胞菌属细菌。其中菌株zx4被鉴定为少动鞘氨醇单胞菌的又一菌株，推测菌株E、A17应当第一章前言第一节多环芳烃菲的微生物降解综述1．多环芳烃的累积和环境毒性多环芳烃(PolycycIicaromatichydrocarbon，PAHs)是由两个或两个以上的苯环以线形排列、弯接或簇聚的方式而

5、构成。队Hs在环境中分布广泛，由于其自身的疏水性及低水溶性，能很快进入到沉积环境中。并且它们随着苯环数量增加，脂溶性越强，水溶性越低，在环境中存在的时间越长，遗传毒性越高。PAHs极易在环境中累积并可通过食物链传递，对人类健康和生态环境具有很大危害性(莫测辉等，2002；蔡全英等，2002：s∞ed甜口，．，1995；Paterson甜口l，1990；Bell甜口正，199l；Xliste＆Alexander，1991)。美国环保局早在上一世纪80年代初便把16种未带分支的PAHs确定为环境中的优先污染物(Yan甜口f

6、，2004)(图1+1)，我国也早把PAHs列入环境优先监测的污染物黑名单。：oo：N-曲lⅫ●时：$：：昂：：嘏：《冷?融：：国：：捣：：豳：：国：：鼢。鹚?图卜116种优先处理的多环芳烃的结构和名称FjgI·lSt兀lcturesandnomenclaturesof16PAHsinEPAprioritypolIutantllst蛳～妒。绱一越一粤磐璺澎第一章前言1．1PAHs的理化和毒性特征天然环境中的PAHs按其物化性质可分为两类：一类为带有2—3个苯环的低分子量的芳香烃．如萘、菲和葸等，这些化合物易挥发，对生物

7、有一定的毒性；第二类为带有4~7个苯环的高分子量芳烃，如芘、荧葸、苯并(a)芘，等，这些化合物沸点高，不易挥发，遗传毒性较高(岳敏等，2003)。PAHs进入生物体内，首先会被细胞色素P450依赖性的混合功能氧化酶(MFO)代谢，某些队Hs经细胞微粒体中的混合功能氧化酶激活后会转化为致癌物，它们通过在蛋白质的酮一烯醇互变异构过程中起催化作用，从而导致细胞蛋白质分子的不可逆转变，进而促进细胞的癌变。如苯并(a)芘代谢与肺癌具有一定的相关性，焦化厂工人肺癌死亡率明显高于其周围居民。研究表明，大气中苯并(a)芘浓度每增加百万

8、分之一，其污染地面的肺癌死亡率可上升5％。此外，在PAHs的代谢过程中往往伴随着大量自由基的产生。自由基具有很强的亲电性，极易与各种生物大分子结合，导致酶失活、蛋白质结构变化、DNA断链、脂质过氧化等一系列氧化损伤。并进一步引起细胞组织器官的病理变化(刘玲．1987；傅娟龄，1989)。而且由于PAHs化学结构的特性，它能稳定地吸