超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法研究

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1、超顺磁性氧化铁纳米粒子标记成肌细胞方法研究【摘要】目的：使用超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO）对成肌细胞进行体外标记，探讨SPIO标记方法及SPIO对细胞的影响.方法：常规方法进行成肌细胞培养，应用脂质体包被的SPIO标记成肌细胞，用光镜及电镜观察标记效率及对细胞增殖的影响，台盼蓝染色及JC1观测SPIO对细胞活力的影响.结果：普鲁士蓝染色证实了每个标记细胞胞质内有多少不等的蓝染铁颗粒，单纯SPIO标记有效率为50%，脂质体包被的SPIO标记有效率为100%，电镜也观测到细胞内的SPIO颗粒.SPIO标记对细胞无毒性，不影响细胞的增殖及

2、活性.结论：脂质体包被SPIO标记成肌细胞方法简单、高效、无毒，可用于磁共振对标记细胞进行活体内外无创动态示踪研究.【关键词】成肌细胞超顺磁性氧化铁磁共振成像　　0引言　　生物治疗是改善和缓解终末期缺血性心脏病的理想手段，其中以细胞移植最有临床应用前景［1］.但需要解决一个重要问题是植入细胞的存活、迁移如何识别和动态监测.MR显微成像是最近出现的显微影像技术，具有较高的分辨率，能够分辨近似于细胞大小的组织［2］,理论上能够动态跟踪移植细胞.但目标细胞必须经MR对比剂标记后才能与背景组织区别而被MR检测到.超顺磁性氧化铁纳米粒子（super

3、paramagneticoxideironparticle,11SPIO）是一种新型磁共振对比剂，本研究我们探讨SPIO标记成肌细胞方法及其对细胞增殖分化的影响，为临床利用MRI技术无创监测移植细胞在心脏内的存活和迁移奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　SD乳大鼠.DMEM培养基,小牛血清(FBS),脂质体2000,JC1（Molecularprobes）均为美国Gibco公司产品.Endorem：超顺磁性氧化铁纳米粒子（SPIO市售制剂，11.2mgFe2+/mL），由荷兰鹿特丹Erasmus大学医学中心放射线科张卓立博士后提

4、供.CO2培养箱、光学显微镜、荧光显微镜及透射电镜.　　1.2方法　　1.2.1成肌细胞分离培养　　将出生3d以内的SD大鼠颈椎脱位法处死，无菌条件下取双下肢肌肉，DHanks液洗去残血，祛除筋膜等周围组织，用含抗生素的无血清培养液冲洗2次，剪成约1mm×1mm×1mm大小肌肉碎块，无血清培养液冲洗2次，静置1min并去上层液及飘浮组织.加5倍体积2g/LⅠ型胶原酶，37℃水浴消化50min，2000r/min离心10min，去上清液，底层细胞和碎片用DMEM洗2次，制成骨骼肌单细胞悬液，再加5倍体积2.5g/L胰蛋白酶，37℃水浴消化

5、30min，释放位于骨骼肌肌膜的成肌细胞，加入150mL/LFBS的DMEM培养液8mL阻止酶消化，2700r/min离心10min，去上清，重悬细胞离心去上清，反复4次，最后一次用211mL不含FBS的DMEM重悬细胞，采用Percoll（细胞分离液）非连续密度梯度离心法除去成纤维细胞，将所得细胞加入150mL/LFBS的DMEM培养基中，吹匀、计数，接种于内置处理过的盖玻片的培养板中.　　1.2.2脂质体包被SPIO方法　　30μL脂质体2000稀释于0.5mLOptiMEM血清培养基中为管1，总量含112μgFe2+的Endore

6、m(SPIO)稀释于0.5mLOptiMEM血清培养基中为管2，5min后混合管1及管2并室温放置20min，获得脂质体包被SPIO的混悬液.总量含112μgFe2+的Endorem稀释于1mLOptiMEM血清培养基，获得单纯SPIO的混悬液.　　1.2.3SPIO标记　　成肌细胞提取传代（第2代）后第2日生长较活跃的成肌细胞，将单纯SPIO混合液及脂质体包被SPIO混合液分别加入含1×106成肌细胞的9mLOptiMEM中（11.2μgFe2+/mL），37℃,50mL/LCO2培养箱中共同培养23h，即可得标记成肌细胞.　　1

7、.2.4SPIO标记的检测　　①光学显微镜检测：利用普鲁氏兰可使SPIO铁离子染色并在普通光学显微镜下可以观察到的特点，用普鲁氏兰对SPIO标记的成肌细胞及脂质体包被SPIO标记的成肌细胞进行染色.具体方法为：将标记成肌细胞移入内置处理过的盖玻片的六孔培养板中.1h后待细胞充分贴壁后，取出盖玻片，DHanks液洗涤3遍，40g/L多聚甲醛固定20min，蒸馏水洗涤2遍，Perls反应液（等体积200mL/L盐酸与100g/L亚铁氰化钾新鲜配制）染色20min，蒸馏水洗涤2遍，511g/L伊红复染3min，蒸馏水洗去多余的伊红，光学显微镜

8、观察SPIO在细胞内的位置、标记率，每个样本进行多视野计数至少500个细胞.②电镜检测：消化收集标记移植细胞，吸去培养基后以25mL/L戊二醛4℃固定15min，离心（2000r/min，10