CR基因扩增及扩增产物的回收

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1、Q&A关于标签：物质描述：名称，浓度，pH值等配制信息：配制人，配制日期等班级（周四318或周四佟），组别关于试剂配制EDTA(乙二胺四乙酸钠），碱性条件下可溶，一般每百毫升加NaOH约4gTris-HCl1mol/L,pH7.4（25℃)生化实验室，2008.09.25MilliQ水（已灭菌，PCR专用）生化实验室，2008.09.251640培养基含FBS10%，含双抗（Jurkat细胞专用）佟丽，2008.09.25手术器械（已除热源）佟丽，2008.09.25PCR基因扩增及其产物回收佟丽2008年9月25日基因的克隆与表达专题之一主要

2、内容目的基因AKP的扩增－PCR扩增产物的分离鉴定－琼脂糖电泳扩增产物的回收－胶回收PCR产物目的产物琼脂糖凝胶分析目的基因AKP的扩增－PCR概述PCR技术原理PCR特点影响因素与条件优化关于本次实验PCR（PolymeraseChainReaction）在体外特异性地扩增某个基因。1993年诺贝尔化学奖KaryB.Mullis概述Saiki使PCR成为实用的方法PCR的种类常规PCRTouch-downPCRRT-PCR兼并引物PCR巢氏PCR反向PCR不对称PCR原位PCRRACE-PCR免疫-PCR(immuno-PCR)MSP甲基化特异P

3、CR等等…………常规PCRRT-PCRPCR技术原理高温变性低温复性（退火）适温延伸适度循环DNA模板高温变性:双链DNA在受热后，配对碱基的氢键断裂，DNA两条链分开成为单链。95oC3’5’TGCATGCATATCTTGAACTAGAACTTGACGTACGTA5’3’5’TGCATGCATATCTTGAAC3’3’5’TAGAACTTGACGTACGTA模板（template）TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’DNA模板与引物复性(退火）:引物Primer，人工合成的单链DNA小片段，碱基

4、顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5’端相同模板模板ATCTTGAAC5’3’ACGTACGTA5’3’引物引物40-65℃DNA链的延伸：DNA聚合酶按碱基互补配对原则在模板上延伸DNA链。TGCATGCATATCTTGAAC3’5’5’TAGAACTTGACGTACGTA3’模板模板ATCTTGAAC5’ACGTACGTA5’TaqTaq72℃理论上25-30次循环就可以合成225-230条DNA变性—复性—延伸1个循环的结果新一轮循环PCR的特点特异性强：①特异的DNA引物。②高温下进行延伸敏感性高:理论上只要一条模板链，32次循环就可合成

5、约109条！快速:整个PCR过程约2～4小时简便:对模板的纯度要求低模板种类多样化PCR反应的影响因素1、TaqDNA聚合酶2、引物3、模板4、dNTP5、Mg2+1.TaqDNA聚合酶热稳定性，耐高温最适温度：75-80℃延伸速度：2000bp/min最长延伸长度：6.7kb没有3’5’外切酶活性合成超过600bp长度的DNA就有可能出现错配TaquaticusTaqDNA聚合酶金属离子敏感（尤其是Mg2+），当dNTP（能结合Mg2+）为0.7-0.8mmol/L时，MgCl2最佳浓度应是2.0mmol/L。50mmol/LKCl也能激活Ta

6、qDNA聚合酶的活性。TaqDNA聚合酶被蛋白酶K降解无3’5’DNA外切酶活性，但高温下能逆转录cDNA，又能扩增DNA有3‘5’外切酶活性，能耐受100oC高温。其它耐热的DNA聚合酶TthDNA聚合酶：VentDNA聚合酶：PfuDNA聚合酶：有3‘5’外切酶活性，是目前已发现的所有耐高温DNA聚合酶中出错率最低的TaqPlusDNA聚合酶：Taq和PfuDNA聚合酶的混合物Taq的PCR产物3’端往往带有一个A基因工程原理（吴乃虎）分子克隆实验指南（第三版）2.引物设计的总原则：扩增的效率和特异性5’端根据需要可设计成某个内切酶的切点

7、顺序、RNA聚合酶识别序列、突变位点或生物素标记等，方便与以后操作。3’端必须与模板正确配对，5’端可以不配对5’ATGACTGATCGATCGATCGAT3’3’GCTAGCTACTTAAG5’templateprimer2.1引物的碱基序列：一般长15—30bp尽可能提高G+C含量，以提高引物与模板的结合力避免连续相同碱基排列或内部回文序列5’GGCAGTCTGCCAGTCTAC3’CTGCCAGTCTAC3’GACGG5’T发卡结构2.2引物的碱基组成：2.3引物内部不能形成二级结构：尽可能随机分布，G+C含量45-55%。两个引物间不能有两

8、个以上连续碱基互补序列2.4避免形成引物二聚体（dimer）5’GGTCTGCCAGTCTAC3’3’CAGGACTTAG