免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项

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1、免疫荧光双标技术中操作要点和注意事项来源：生物谷  2008-6-27 访问量：9826评论（0）分享一、免疫荧光的标本制作的基本程序同DAB显色的免疫组化，不同点如下：1、免疫荧光不需要使用双氧水处理，封闭和一抗孵育与其它相同。2、免疫荧光的二抗使用不同荧光标记的二抗孵育，孵育时间根据抗体的工作浓度确定。3、二抗孵育之后充分洗片后即可贴片、封片和观察。4、免疫荧光在封片使用专用封片剂或甘油：0.01MPBS（1：1）。5、条件许可可以购买防淬灭的试剂加入封片剂中，标本可以保存更久。6、荧光抗体的孵育以及后续处理需要闭光。7、荧光抗体染色假阳

2、性可能会多，需要设定阳性和阴性对照。二、注意事项1、荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，时间过长，会使荧光减弱。2、每次试验时，需设置以下三种对照：（1）阳性对照：阳性血清+荧光标记物（2）阴性对照：阴性血清+荧光标记物（3）荧光标记物对照：PBS+荧光标记物三、免疫荧光双标的经验之谈1、选取primaryantibodies时要来源于两种不同的动物，我用的是来源于rabbit和rat的抗体，secondaryantibodies则是不同荧光信号标记的，我用的是donkeyanti-rabbit-FITC（绿）和donkeyan

3、ti-rat-Tex-Red（红）。2、我的做法是两种primaryantibodies同时孵育，然后两种secondaryantibodies同时孵育。抗体浓度、孵育时间要认真摸索，我感觉primaryantibodies4度孵育过夜比较好，背景比较干净。3、我的阳性对照采用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是rabitt和rat的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。4、Block用的血清使secondaryantibody来源动物的血清，我的是10%正常donkey血清。5、其余同一般操作。原代培养胚胎14天大鼠端脑细胞：在骨发生形

4、态蛋白—{诱导下，乙酰胆碱转移酶(呈绿色荧光)和同源域蛋白Islet—1(呈红色荧光)共存于细胞质内(激光扫描共聚焦显微镜观察)    1．一步双染色法先将两种荧光标{己抗体按适当比例混合(A+B)，按直接法进行染色。    2．二步双染色法先用TRITC标记的A抗体进行免疫荧光染色，再用FITC标记的B抗体染色，根据两种抗体的动物种属不同，可用直接法也可用间接法，结果A抗原呈现橘红色荧光，而B抗原呈现黄绿色荧光。在应用中，常用的方法是免疫荧光组织化学中间接法和SABC-Cy3法相结合。例如，在实验设计时，选择小鼠抗大鼠A和兔抗大鼠B作为两种

5、不同的特异性一抗，相匹配的二抗分别为FITC-抗小鼠IgG和生物素化—抗兔IgG。进行双重染色时，由于两种一抗种属来源不同，可把一抗混合使用。孵育结束后洗涤未结合的一抗，滴加二抗时，先加人生物素化—抗兔IgG(二抗)孵育，洗涤后，滴加SABC-Cy3复合物，经荧光显微镜下观察已出现特异性荧光，再进行FITC—抗小鼠IgG(二抗)的孵育，最后封片观察。其结果A抗原呈现绿色荧光，B抗原呈现红色荧光。此法应注意两种一抗在混合稀释时，抗体的终浓度应为每一种抗体的工作浓度。换言之，混合后的液体要同时满足两种一抗的工作浓度。若两种一抗种属来源相同，必须分

6、两次进行双重染色，即先用第一种一抗和第一种荧光二抗对A抗原进行染色，洗涤后，用第二种一抗和第二种荧光二抗对B抗原进行染色，否则会出现交叉反应而使染色无特异性。双重免疫荧光标记法    在同一组织细胞标本上需要同时检测两种抗原时，需进行双重荧光染色。双重免疫荧光标记法(doubleimmunofluorescencelabelingmethod)也分为直接法和间接法。    (1)直接法双重免疫荧光标记：将标记有两种不同荧光素的抗体(如抗A和抗B)以适当比例混合，滴加在标本上孵育，然后洗去未结合的荧光抗体，在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤

7、片观察，即可对两种抗原进行定位和定量。直接法简便可靠，但灵敏度较低。    (2)间接法双重免疫荧光标记：用未标记的两种特异性第一抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第一抗体后，再用两种不同的荧光素分别标记的第二抗体孵育组织或细胞，洗去多余的第二抗体，后在荧光显微镜下分别选择两种相应的激发滤片观察，从而对两种抗原进行定位和定量。使用此法应注意两种特异性第一抗体必须来源于不同种属，且荧光标记第二抗体的种属必须与第一抗体的种属相匹配。