基于多种信号放大策略构建检测疾病标志物的电化学生物传感器研究

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单位代码10653学号112013316001137硕士学位论文基于多种信号放大策略构建检测疾病标志物的电化学生物传感器研究论文作者：井佩指导教师：许文菊副教授学科专业：分析化学研究方向：纳米材料及电化学生物传感器提交论文日期：2016年4月20日论文答辩日期：2016年5月30日学位授予单位：西南大学中国重庆2016年5月 目录摘要........................................................................................................................IABSTRACT.................................................................................................................III第一章绪论..................................................................................................................11.1电化学生物传感器概述..................................................................................11.2信号放大技术在电化学生物传感器中的应用..............................................41.3本论文的选题依据及研究思路......................................................................9第二章基于钯纳米修饰的功能化石墨烯-二硫化钼花状纳米材料和酶催化放大构建的凝血酶电化学适体传感器..............................................................................112.1引言................................................................................................................112.2实验部分........................................................................................................122.3结果与讨论....................................................................................................142.4结论................................................................................................................20第三章基于卟啉铁/G-四链体作为信号标签和仿双酶活性的Fe3O4-Au作为纳米载体构建的凝血酶电化学适体传感器......................................................................213.1引言................................................................................................................213.2实验部分........................................................................................................223.3结果与讨论....................................................................................................243.4结论................................................................................................................30第四章基于目标物诱导多肽剪切的信号‘on-off’型的多肽传感器用于基质金属蛋白酶-2检测……….…………………………………………………………...…..314.1引言................................................................................................................314.2实验部分........................................................................................................324.3结果与讨论....................................................................................................344.4结论................................................................................................................41参考文献......................................................................................................................43作者发表的部分相关论文题录..................................................................................53致谢......................................................................................................................55 摘要基于多种信号放大策略构建检测疾病标志物的电化学生物传感器研究分析化学专业硕士研究生井佩指导教师许文菊副教授摘要电化学生物传感器是将电化学分析方法与生物传感器相结合发展而来，具有灵敏度高、选择性好、响应速度快、成本低等优点，在生物分析、临床检测、环境监测等领域具有广泛应用。为了改善传感器各项分析性能，多种信号放大策略被用于电化学传感器的构建。其中，纳米材料由于具有比表面积大、导电性好以及电催化活性高等优点，为电化学生物传感器的发展提供了新思路。本论文将多种功能化纳米材料作为生物分子的固载基质，并将电化学传感技术与纳米材料放大、酶催化放大、杂交链式反应放大等放大技术相结合，以凝血酶（TB）、基质金属蛋白酶-2（MMP-2）为检测对象，构建了几种灵敏的电化学生物传感器。1．基于纳米钯修饰的石墨烯-二硫化钼花状纳米复合物和酶催化放大的凝血酶电化学适体传感器研究该体系在聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDDA）存在时，将二硫化钼（MoS2）原位还原在石墨烯纳米片上，制备出具有大比表面积、良好导电性和花状结构的功能化石墨烯/二硫化钼纳米复合物（PDDA-G-MoS2）；并用钯纳米进行修饰，得到的复合物（PdNPs/PDDA-G-MoS2）进一步固载卟啉铁/G-四链体、葡萄糖氧化酶（GOD）和氧化还原探针甲苯胺蓝（Tb），构建灵敏的夹心型TB电化学适体传感器。通过GOD有效催化葡萄糖的氧化，同时将溶解氧还原为H2O2；H2O2又被具有仿过氧化物模拟酶活性的PdNPs和卟啉铁/G-四链体催化分解，而实现电化学信号的逐级放大，提高传感器的灵敏度。适体传-1-1-1感器的线性范围为0.1pmol·L~40nmol·L，检测下限为0.062pmol·L。2．基于卟啉铁/G-四链体作为信号标签和仿双酶活性的金包四氧化三铁作为纳米载体构建的凝血酶电化学适体传感器该体系以具有仿双酶性质的金包四氧化三铁（Fe3O4-Au）作为纳米载体，卟啉铁/G-四链体作为信号标签，卟啉铁/G-四链体和Fe3O4-Au作为模拟酶催化放大响应信号为基础，构建一个无酶的电化学适体传感器用于检测TB。其中，Fe3O4-Au复合纳米材料不仅具有大的比表面积和良好的生物相容性能够固载大量的具有电化学活性的卟啉铁/G-I 西南大学硕士学位论文四链体，它还具有优越的仿葡萄糖氧化酶和仿过氧化物模拟酶的仿双酶特性。基于仿葡萄糖氧化酶的活性，Fe3O4-Au复合纳米材料表面的金纳米颗粒（AuNPs）能够有效催化葡萄糖的氧化，并将溶解氧转化为H2O2。接着，同时具有仿过氧化物模拟酶活性的Fe3O4-Au复合纳米材料的Fe3O4核和卟啉铁/G-四链体能够共同催化H2O2的分解，从而促进卟啉铁的电子传递，实现响应信号的逐级催化放大，进而提高传感器的灵敏度。所-1-1构建的电化学适体传感器的线性范围为0.1pmol·L~20nmol·L，检测下限为0.013-1pmol·L。3．基于目标物诱导多肽剪切的信号‘on-off’型的多肽传感器用于基质金属蛋白酶-2检测本研究基于目标物诱导多肽剪切以及纳米材料和杂交链式反应(HCR)放大，构建信号‘on-off’型的检测MMP-2的电化学多肽传感器。制备的单链DNA-多孔铂纳米-多肽生物偶合物（S1-pPtNPs-P1）用作纳米探针。其中生物素标记的多肽（P1）包含有目标物MMP-2的剪切位点，为构建‘on-off’型的电化学传感平台提供了可能。通过生物素与亲和素的特异性结合将S1-pPtNPs-P1固定在电极表面。引发HCR后，将电活性物质硫堇（Thi）嵌入双链DNA中。pPtNPs有效地催化H2O2的分解，能够大大增强Thi的电化学信号，此时为信号‘on’状态。目标物MMP-2存在时，多肽在特定位点被剪切，pPtNPs和电活性的Thi将离开电极表面，导致电化学信号明显降低，此时为信号‘off’状态。结合纳米材料催化、HCR放大、信号‘on-off’策略，构建的电化学多肽传感器具有较高的灵敏度和稳定性，其-1-1-1中检测范围为1pg·mL~10ng·mL，检测下限为0.32pg·mL。关键词：纳米材料生物放大技术电化学生物传感器凝血酶基质金属蛋白酶-2II ABSTRACTStudyonelectrochemicalbiosensorbasedonmultipleamplifyingtechniquesforthedetectionofbiomakersAnalyticChemistryMasterPostgraduate:PeiJingSupervisor:AssociateProfessorWenjuXuABSTRACTElectrochemicalbiosensorsweredevelopedbyintegratingelectrochemicalanalyticalmethodsandbiosensors.Withthemeritsofhighsensitivity,goodselectivity,rapidresponse,lowcost,theelectrochemicalbiosensorhasbeenextensivelyusedinbiologicalanalysis,clinicaldetection,environmentalmonitoringandsoon.Inordertoimprovethepropertyoftheelectrochemicalbiosensor,multipleamplifyingtechniqueshavebeenemployedtoconstructbiosensor.Amongthem,nanomaterialsshowboardapplicationprospects,owingtotheircharacteristicsoflargespecificsurfacearea,goodelectricconductivityandelectrochemicalcatalysisactivity.Therefore,thearticleusesvariousfunctionalnanomaterialsasnanocarriersandfocusesonthecombinationofnanomaterialswithappropriateamplifyingmethods(enzymecatalysisamplificationandhybridizationchainreactionamplification)todevelopaseriesofsensitiveelectrochemicalbiosensorsforthedetectionofthrombin(TB)andmatrixmetalloproteinase2(MMP-2).Part1Asensitiveelectrochemicalaptasensorbasedonpalladiumnanoparticles-functionalgraphene-molybdenumdisulfideflower-likenanocompositesandenzymaticsignalamplificationInthisstudy,poly(diallyldimethylammoniumchloride)functionalgraphene/molybdenumdisulfidenanocomposites(PDDA-G-MoS2)werepreparedandfurtherimmobilizedwithPdNPs.Withflower-likestructure,largesurfaceareaandexcellentconductivity,PdNPs/PDDA-G-MoS2wasusedasnanocarriersandfunctionalizedbyhemin/G-quadruplex,glucoseoxidase(GOD),andtoluidineblue(Tb)asredoxprobes.GODcouldeffectivelycatalyzetheoxidationofglucose,couplingwiththereductionofthedissolvedoxygentoH2O2.Then,bothPdNPsandhemin/G-quadruplexactingashydrogenperoxidemimickingenzymecouldfurthercatalyzethereductionofH2O2,resultinginsignificantelectrochemicalsignalamplification.Theproposed-1aptasensorshowedhighsensitivitywithawidedynamiclinearrangeof0.0001to40nmol·LandIII 西南大学硕士学位论文-1arelativelylowdetectionlimitof0.062pmol·LforTBdetermination.Part2AnamplifiedelectrochemicalaptasensorforthrombindetectionbasedonpseudobienzymicFe3O4-Aunanocompositesandelectroactivehemin/G-quadruplexassignalenhancersAnelectrochemicalaptasensorforTBdetectionwasconstructedbasedonhemin/G-quadruplexassignallabelandFe3O4-Aunanocompositeswithglucoseoxidase(GOx-)andperoxide-mimickingenzymeactivityassignalenhancers.Duetothelargesurfaceareaandgoodbiocompatibility,Fe3O4-Aunanocompositeswereemployedtoimmobilizeamountofelectroactivehemin/G-quadruplex.BasedontheGOx-mimickingenzymeactivity,Aunanoparticles(AuNPs)onthesurfaceofFe3O4-AueffectivelycatalyzedtheoxidizationofglucoseinthepresenceofdissolvedO2,accompanyingwiththeproduceofH2O2.BothFe3O4coresofFe3O4-Auandhemin/G-quadruplexwithhydrogenperoxidemimickingenzymeactivitycouldcatalyzethereductionofthegeneratedH2O2,whichpromotedtheelectrontransferofheminandamplifiedtheelectrochemicalsignal.Theproposedelectrochemicalaptasensorshowedawide-1-1-1dynamiclinearrangeof0.1pmol·L-20nmol·Lwithalowerdetectionlimitof0.013pmol·L.Part3A‘signalon-off’electrochemicalpeptidebiosensorformatrixmetalloproteinase2basedontargetinducedcleavageofpeptideInthiswork,a‘signalon-off’electrochemicalpeptidebiosensorwasdevelopedforthedeterminationofMMP-2onthebasisoftargetinducedcleavageofaspecificpeptideusingnanomaterialsandHCRasamplificationstrategies.ThepreparedS1-pPtNPs-P1bioconjugateswereemployedasnanoprobes,wherethebiotion-labeledpeptide(P1)wasusedasacleavage-sensingelement,offeringthecapabilityof‘on-off’electrochemicalsignallingforthetargetMMP-2.S1-pPtNPs-P1wasimmobilizedontheelectrodesurfacethroughtheconjunctionofbiotin-streptavidin.Then,HCRwastriggeredtoembedtheelectroactivethionine(Thi).pPtNPscouldeffectivelycatalyzedthedecompositionofH2O2,resultingintheelectrochemicalsignalofThienhancedsignificantly(‘signalon’state).UponcleavagewithMMP-2,pPtNPsandThileftfromtheelectrodesurface,leadingtoobservablydecreasedelectrochemicalsignalofThi(‘signaloff’state).OwingtothecombinationofnanomaterialsamplificationwithHCR,theproposed‘signalon-off’electrochemicalpeptidebiosensorexhibitedgoodsensitivityandsatiabilitywitha-1-1-1detectionlimitof0.32pg·mLandwidelinearrange:1pg·mL-10ng·mL.Keywords:Nanomaterials;Biologicalamplificationstrategy;Electrochemicalbiosensor;Thrombin;Matrixmetalloproteinase2IV 第一章绪论第一章绪论1.1电化学生物传感器概述生物传感器（biosensor），是由生物学、物理学、化学、医学以及信息学等多种学科相互交叉发展的产物，能够实现对所需检测的物质进行及时、快速准确分析和追踪。早在1962年，英国学者Clark就利用酶的生物活性与待测物的特异性[1]反应，将生物学原理与传感器相结合设计了一种新型的葡萄糖传感器，开创了生物传感器研究的新局面。与传统的化学传感器相比，生物传感器具有制备简单、灵敏度高、分析速度快、选择性好、价格低廉、能够高度自动化、微型化和集成化等优点，在生物学、食品、药品、工业、医学以及环境检测等领域具有广泛的[2-3]应用和前景。生物传感器以固定化的生物成分（酶、核酸适体、抗原、多肽、细胞、激素等）作为分子识别元件，通过信号转换器将生物识别反应转化为可测量的光、电、热等信号。根据信号转化器的不同，生物传感器可分为电化学生物[4][5][6][7]传感器、光学生物传感器、热生物传感器、压电晶体生物传感器和半导体[8]生物传感器。作为生物传感器的重要分支，电化学生物传感器是最早研究的，也是发展最为迅速的领域之一。电化学生物传感器由生物识别元件、信号转换元件和电子线路三大部分组成，其检测原理如图1.1所示。首先将生物识别元件固定在电极表面，通过生物识别作用将目标分子捕获在电极表面，然后通过电极将浓度信号转化为可测量的电化学信号，根据在一定浓度范围内电信号与待测物质的浓度呈现的线性关系，实现对目标物的定量分析。电化学生物传感器与其它生物传感器的不同之处在于转换元件是由不同的电极组成（如固体电极、离子选择性电极、气敏电极等）；信号输出是以电流、电阻、电势或电容等电信号为特征检测信号。图1.1电化学生物传感器工作原理示意图Fig.1.1Theschematicdiagramoftheprincipleofelectrochemicalaptasensor.[9]根据生物识别元件的不同，电化学生物传感器可分为：酶电极传感器、电化[10][11][12]学适体传感器、电化学多肽传感器、微生物电极传感器、电化学免疫传感[13][14][15][16]器、电化学DNA传感器、组织电极传感器、细胞器电极传感器等。其中，基于核酸适体和多肽作为生物敏感元件的电化学传感器研究的较为广泛。接下来的内容将着重讨论电化学适体传感器和电化学多肽传感器，以及应用在这些1 西南大学硕士学位论文传感器中的纳米材料和信号放大技术。1.1.1电化学适体传感器适体（aptamer），也叫适配体或核酸适体，是通过指数富集的配体系统进化技术（简称SELEX），从在体外约1015~1018种核苷酸分子文库里筛选出的一段由[17]25~80个DNA或RNA碱基组成的寡核苷酸片段，能与蛋白质、小分子、细胞、小分子、金属离子、氨基酸等目标物结合。与另一种识别物质抗体相比，适体具有分子量较小、合成成本低、制备简单、易于标记、特异性高、稳定性和再现性[18-20]好、可反复使用和长期保存等优点。基于此，以适体作为生物识别元件，与电化学方法相结合而构建的电化学适体传感器得到了很大的发展。电化学传感器[21][22][23]的定量检测方法有很多，包括循环伏安法、差分脉冲伏安法、方波伏安法、[24][25][26]线性扫描伏安法、溶出伏安法和电化学阻抗法等。其中，由于差分脉冲伏安法的灵敏度最高而备受关注。此外，根据适体是否被标记，可将电化学适体传[27][28]感器分为两类：免标记型和标记型。免标记型电化学适体传感器中不需要对适体进行任何标记，根据目标物结合前后电化学信号的变化而实现对目标物的定量检测。其具有制备简单、成本低、易操作等优点，但灵敏度不高。标记型电化学适体传感器是指通过共价键、静电吸附、生物素-亲和素特异性结合等方法在适体上修饰纳米材料（贵金属、石墨烯、金属氧化物、量子点等）、氧化还原分子（Fc、亚甲基蓝MB、甲苯胺蓝Tb、六铵合钌RuHex、硫堇Thi等）或酶（辣根过氧化物酶HRP、葡萄糖氧化酶GOD、乙酰胆碱酯酶AChE等）。标记型的电化学适体传感器由于比免标记型的具有更高的灵敏度而备受广大研究者的青睐。近年来，运用夹心法的标记型适体传感器由于具有目标物不用标记，能够减少假阳性信号、实现信号放大等优点而成为检测具有两个或多个结合位点的目标物的理想选择。基于固载适体-目标分析物-第二适体模式形成类似与三明治结构的夹心型电化学适体传感器，其通过标记的第二适体所引起的电化学信号的变化来[29]实现对目标物的定量检测。Wang等首先在GCE表面修饰固载有金纳米的石墨烯纳米片（Au@GS），通过Au-S键将巯基标记的凝血酶适体（Apt1）捕获在电极表面，通过特异性识别作用将目标物TB固定在电极上，再通过夹心反应将双金属钴钯纳米粒子（CoPdNPs）标记的凝血酶第二适体（Apt2）引入到电极表面，形成夹心型结构（图1.2）。由于CoPdNPs能够有效催化H2O2的分解而放大电流信号，能够实现TB的高灵敏检测。2 第一章绪论[29]图1.2夹心型电化学适体传感器的构建过程[29]Fig.1.2Thepreparedprocedureofthesandwich-typeelectrochemicalaptasensor.1.1.2电化学多肽传感器肽，是指由两个或两个以上氨基酸通过脱水缩合作用形成的化合物。根据所含氨基酸数目可将其分为：小分子肽或寡肽（含2-10个氨基酸）、多肽（含10-50[30]个氨基酸）；而含有50个以上的氨基酸的肽衍生物属于蛋白质。多肽具有分子量小、制备简单、构型多样、生理活性显著、修饰简单，稳定性好等优点，并且能与许多种目标物分子具有高度的特异性与亲和力，例如，蛋白质、核酸、离子、[31-33]分子、细胞等。因此，基于多肽作为分子识别元件构建的多肽传感器日益受到关注。目前，发展的基于多肽的传感器中检测方法主要有电化学方法以及荧光法。其中，电化学多肽传感器是将多肽、生物传感器与高灵敏度的电化学传感技术相结合而获得的检测装置。电化学多肽传感器中较为关注的领域是蛋白质的检测。根据目标蛋白质与分子识别元件多肽的结合方式不同，多肽传感器可分为非剪切型与剪切型。非剪切型是指目标物与多肽作用为结合的方式，与目标物作用后分子识别元[34]件多肽只发生构型上的变化，组成没有发生变化。例如，Gerasimov等设计了能够特异性识别HIVanti-p24抗体的多肽（序列为：EAAEWDRVHP），并在其氨基端修饰巯基、羧基端修饰电活性物质MB。通过Au-S共价键将多肽捕获在金电极表面，并用巯基己醇进行封闭。目标物结合前后，多肽构型发生变化，羧酸端标记的MB与电极表面的距离发生改变，电化学信号也随之发生改变（如图1.3所示）。根据目标物结合前后电流的变化量，实现对目标物的定量检测。剪切型是指目标物能够识别并剪切具有特定序列的多肽，与目标物作用后分[35]子识别元件的组成发生变化。例如，Xu等设计特定序列的多肽（CALNNGPLGVRGRAK）作为分子识别元件，以Fc为电活性物质，构建高灵敏剪切型基质金属蛋白酶-2（MMP-2）电化学多肽传感器（如图1.4）。首先通过Au-S键，将羧酸端和氨基端分别标记有巯基和Fc的多肽固定在金电极表面，此时有较3 西南大学硕士学位论文强的电化学信号。目标物存在时，MMP-2能够识别其对应的专一序列（PLGVR）并对其进行剪切，被剪切的多肽裂解为两段，其中标记有Fc的多肽片段脱离电极表面，电极表面Fc的量减少，电化学信号降低。根据电化学信号的变化值，实现对MMP-2的定量检测。[34]图1.3非剪切型电化学多肽生物传感器的构建过程[34]Fig.1.3Thepreparedprocedureoftheuncleavageelectrochemicalpeptide-basedbiosensor.[35]图1.4剪切型电化学多肽生物传感器的构建过程[35]Fig.1.4Thepreparedprocedureofthecleavageelectrochemicalpeptide-basedbiosensor.1.2信号放大技术在电化学生物传感器中的应用随着科学技术的发展及人民生活水平的提高，对一些与疾病相关的痕量蛋白的检测提出了新的要求，发展灵敏度高、响应迅速的电化学生物传感器成为研究的热点。为实现痕量蛋白定量测定的目的，在实际构建传感器的过程中，研究者们运用多种信号放大策略来增强检测信号，降低背景信号，提高传感器的检测性能，使其具有较宽的检测范围、良好的重现性和较高的灵敏度。下面就不同信号放大技术在电化学生物传感器的应用分别作简要介绍。1.2.1纳米材料放大技术纳米材料，是指在三维空间中至少有一维处于1-100nm尺度范围或由它们作为基本单元构成的材料。与宏观材料相比，纳米材料由于具有独特的物理化学性4 第一章绪论质，使其表现出独特的电化学、光学、磁学、力学等性能。纳米材料的表面效应和小尺寸效应使其具有高的表面自由能和大的比表面积，并且在与其它原子结合[36-37]时表现出高的化学活性，能够有效增加生物分子的固载量。纳米材料的宏观量子隧道效应使其具有良好的导电性，作为电极的固载基质或纳米载体能够提高[38-39]电子的传导速率和传感器的响应速度。纳米材料还具有优越的生物相容性，[40]能提供有利于保持生物分子活性的微环境，从而提高传感器的稳定性。此外，许多纳米材料对特定的底物具有较高的电催化性能，能提高传感器的分析性能。[41,44][42]目前，应用较为广泛的纳米材料有贵金属纳米材料、碳纳米材料、金属氧[43]化物纳米材料等。[45]图1.5（A）第二适体纳米探针的制备，（B）夹心型电化学适体传感器的构建过程Fig.1.5Thepreparedprocedureofthesecondaryaptamernanoprobe(A)andthesandwich-type[45]electrochemicalaptasensor(B).[45]Sun等将同时具有仿过氧化物模拟酶活性的Fe3O4、MnO2、金钯核壳纳米球（Au@Pd）相结合，得到具有良好磁性和电催化活性的纳米复合材料Fe3O4/MnO2/Au@Pd。如图1.5所示，以该纳米复合材料为载体固载巯基标记的富含G碱基的TLS11a适体，辣根过氧化物酶封闭剩余活性位点，加入卟啉铁形成卟啉铁/G-四链体结构，最终得到第二适体纳米探针。基底玻碳电极应用导电性良好的AuNPs进行修饰用来固定巯基标记的TLS11a适体，并用巯基己醇进行封闭。利用TLS11a适体对人肝癌细胞（HepG2）的特异性识别作用，将目标物HepG2和第二适体复合物通过夹心的结合方式引入到电极表面。当测试底液中加入H2O2，HRP以及具有仿酶活性的Fe3O4、MnO2、Au@Pd、卟啉铁/G-四链体能够大限度的催化H2O2分解，从而使对苯二酚发生还原反应产生可检测的电化学信号。由于具有大的比表面积和好的生物相容性，Fe3O4/MnO2/Au@Pd纳米复合材料能够固载大量的活性较高的HRP和卟啉铁/G-四链体。并且结合多种纳米材料仿酶催化、酶催化等信号放大策略，构建的电化学适体传感器具有较高的灵敏度，检测下限可达-1到15cellsmL。5 西南大学硕士学位论文1.2.2生物素-亲和素系统放大技术生物素-亲和素系统是通过生物素与亲和素的高特异性结合而建立的。生物素与亲和素相结合的特异性很高，之间的亲和力比抗原抗体之间的高出6-7个数量级，一个亲和素分子可结合4个生物素分子。此反应为不可逆反应，在酸、碱、变性剂、水解酶、有机溶剂条件下均不会发生破坏。此外，利用共价键的方法，很容易在蛋白质、多肽、DNA链等表面结合上亲和素。因此，生物素-亲和素系统的多级放大作用能被应用在电化学生物传感器的构建中。图1.6（A）DNA-多肽生物偶合物的制备，（B）信号纳米探针的制备,（C）两组份检测的电化[46]学多肽传感器的构建及检测原理Fig.1.6PreparationofDNA-peptidebioconjugates(A)andsignalnanoprobes(B).Schematicillustrationoftheelectrochemicalpeptide-basedbiosensorandthemeasurementprincipleofthe[46]assay(C).[46]Liang等利用生物素-亲和素系统，将DNA技术引入到多肽传感器中，构建了同时检测胰蛋白酶和糜蛋白酶的DNA-多肽电化学生物传感器。如图1.6所示，通过生物素与亲和素（SA）的结合作用，将同时标记有生物素的两种多肽（S1、S2）分别与DNA1和DNA2相结合，形成DNA-亲和素-多肽生物偶合物（记为DNA1-S1、DNA2-S2）。在AuNPs表面修饰上与DNA1互补的序列DNA1’，并标记上电活性物质Thi，形成DNA1’-AuNPs-Thi纳米探针。同样的方法，制备出DNA1’-AuNPs-Fc纳米探针。接着，将DNA1-S1、DNA2-S2同时固定在金电极表面，孵育两种纳米探针后，通过碱基互补配对形成DNA双链，引入大量电化学活性物质产生电化学信号。目标物胰蛋白酶和糜蛋白酶存在时，能识别相对应的多肽序列并进行剪切，被剪切的多肽裂解为两部分，标记有信号探针的多肽片段离开电极表面，电化学信号降低。根据剪切前后两种电流信号的变化大小，实现两种目标物的同时检测。通过生物素-亲和素系统以及AuNPs的放大作用，电极表面6 第一章绪论固载的电活性物质的量得到提高，从而使传感器的灵敏度得到提高。其中，胰蛋-1白酶和糜蛋白酶的检测限分别达到1.8和1.2ng∙mL。1.2.3酶催化放大技术在电化学生物传感器的构建中，酶的高效催化活性通常被用来产生或放大电化学信号，提高传感器的灵敏度。酶催化不仅高效而且具有高度的专一性。酶催化放大通过酶催化底物发生氧化还原反应，增强其自身或电子媒介体和电极表面的电子传递，从而放大检测信号，显著提高传感器的灵敏度和改善各项分析性能。近年来，在电化学生物传感器构建中应用比较广泛的酶有HRP、GOD、AChE、乙醇氧化酶（AOx）、碱性磷酸酯酶（ALP）等。[47]图1.7电化学适体传感器的制备过程及信号放大过程示意图Fig.1.7Illustrationofthestepwiseelectrochemicalaptasensorfabricationandtheprincipleofsignal[47]amplification.[47]Bai等利用具有良好的生物相容性和大的比表面积的铂纳米修饰的还原氧化石墨烯（PtNPs@rGO）作为纳米载体，用来固载GOD及凝血酶适体（TBA），形成TBA-GOD-PtNPs@rGO复合物。通过夹心反应构建检测凝血酶（TB）的高灵敏电化学适体传感器（如图1.7所示）。PtNPs@rGO的引入，增加了GOD和适体的固定量。当在检测液中加入葡萄糖后，GOD催化葡萄糖的氧化，并原位产生H2O2。并且，PtNPs能够继续催化H2O2的分解从而促进酶的催化作用，加快GOD自身电子传递。同时，利用空心管状结构的树枝状聚氨基胺-碳纳米管复合材料（PAMAM-CNT）修饰玻碳电极表面，加快电极表面的电子传递速度。当TB浓度越大，引入电极表面的TBA-GOD-PtNPs@rGO复合物就越多，催化能力就越强，-1实现检测信号的放大和传感器灵敏度的提高，检测限为0.21pmol∙L。1.2.4DNA模拟酶催化放大技术7 西南大学硕士学位论文DNA模拟酶，是指由富含G碱基的寡核苷酸片段与卟啉铁配位形成的具有仿[48-49]过氧化物模拟酶活性的复合物，也叫G-四链体DNAzyme。相比于蛋白酶HRP，G-四联体DNAzyme体积小更易修饰在其它分子上，并且具有稳定性好、制备简单、成本低等优点。此外，G-四联体DNAzyme作为催化基团，由于其自身具有氧化还原活性，能够避免传感器构建过程中其它电活性物质的引入，简化了制备过程。[48]Jiang等直接将富含G碱基的凝血酶适体固定到修饰有AuNPs电极表面，并加入卟啉铁形成具有电化学活性卟啉铁G-四链体，构建用于TB检测的电化学适体传感器（图1.8所示）。当有目标物凝血酶存在时，卟啉铁G-四链体与凝血酶稳定结合不被核酸外切酶I（ExoI）所剪切，表现出较强的电化学信号。不存在目标物时，形成的卟啉铁G-四链体中的凝血酶适体链被ExoI剪切，释放出卟啉铁，表现出较弱的电化学信号。根据电化学信号与目标物分析浓度成正比，实现对TB的定量检测。[48]图1.8卟啉铁G-四链体用于凝血酶电化学适体传感器[48]Fig.1.8Theapplicationofhemin/G-quadruplexintheelectrochemicalaptasensorforthrombin.1.2.5DNA循环放大技术随着DNA技术的高速发展，许多基于DNA循坏的放大技术被用于生物感器的构建中，用来提高传感器的灵敏度。常用的技术有杂交链式反应（HCR）、滚环扩增反应（RCA）、聚合酶链反应（PCR）、连接酶链式反应（LCR）、环介导恒温扩增反应（LAMP）等。其中，HCR是通过一小段单链DNA片段作为引发剂，在无酶以及等温的条件下诱导两条发夹型结构DNA交替杂交聚合，形成具有二维或三维结构的双链DNA。由于需要引发剂的触发，HCR的使用能够达到减少假阳性信号，降低背景信号的目的。此外，HCR由于具有所需条件温和且不需要酶的协助、操作简便等优点而备受关注。[50]Qin等利用HCR构建了检测TB的电化学适体传感器。如图1.9所示，首先通过Au-S键将发夹型分子信标2（MB2）固定在金电极表面。当有目标物TB存在时，含有凝血酶适体序列的分子信标1（MB1）发夹结构被打开，形成TB-适体8 第一章绪论复合物。将TB-适体复合物引入到电极表面后，通过碱基互补配对呈单链结构的MB1能够将MB2打开，形成具有裸露部分的双链DNA，并将TB释放出来，释放出的TB继续与下一个MB1结合，实现目标物的循环放大。接着，裸露出的DNA片段能够引发发夹结构H1和H2发生HCR，生成长的聚合双链DNA结构。利用双链DNA中带负电的磷酸骨架，通过电沉积的方法将大量的银纳米离子沉积在DNA双链结构中，产生较高的可检测的电化学信号。通过HCR的放大，实现TB的高灵敏检测。[50]图1.9HCR在电化学适体传感器构建中的应用及其检测原理示意图[50]Fig.1.9TheprinciplefortheelectrochemicalaptasensorbasedonHCRamplification.1.3本论文的选题依据及研究思路人体中一些蛋白质的含量与健康息息相关，可作为疾病预防与诊断以及评判人体健康的重要指标。例如，TB是血液中胰岛素类的丝氨酸蛋白酶，在可溶性的[51]纤维蛋白原转化成不溶性的纤维蛋白的过程中起着至关重要的作用。而且它还[52]与一些生理和病理过程的血栓息息相关，如白血病、动脉血栓形成、肝病等。再如MMPs-2属于锌离子依赖性蛋白水解酶，分布于细胞外表面，是细胞外基质[53]重构及降解的重要介质。MMPs-2能够降解VI型胶原蛋白，其调节失衡和激活[54]与肿瘤的入侵和转移密切相关，如结肠癌、膀胱癌以及肺癌等。而且，与疾病相关的蛋白质在生物样本中的含量较少，因此构建灵敏、简单、高效的方法，实现疾病标志物的定量检测具有十分重要的研究意义。本文的研究目的是将多种信号放大策略引入到电化学生物传感器的构建中，以提高传感器的性能与稳定性。研究工作如下：1.以功能化石墨烯-二硫化钼花状纳米材料（PDDA-G-MoS2）为载体原位还原钯纳米生成PdNPs/PDDA-G-MoS2复合纳米材料，用于固载凝血酶适体、电活性物质Tb以及GOD，并将卟啉铁嵌入凝血酶适体链中，制得卟啉铁/G-四链体耦合的Tb-PdNPs/PDDA-G-MoS2纳米复合物。将该纳米复合材料为信号探针，构建用于TB检测的夹心型电化学适体传感器。利用PDDA-G-MoS2大的活性比表面积，以提高Tb和GOD的固载量以及适体与目标物的结合效率。固载的GOD能有效催化葡萄糖的氧化产生H2O2，生成的H2O2进一步被具有仿过氧化物模拟酶活性的9 西南大学硕士学位论文卟啉铁/G-四链体和PdNPs协同催化分解，从而得到增强的电化学响应信号，提高检测的灵敏度。2.上一工作中，我们采用电活性物质Tb对纳米复合材料进行标记，并应用酶的催化活性实现信号放大。酶存在价格昂贵容易失活的缺点，而且酶的使用会影响传感器的稳定性，使传感器的制备成本较高。本工作将具有优越催化性能和良好氧化还原活性的卟啉铁/G-四链体作为信号探针，能够有效避免其他电活性物质的引入；并以具有大比表面积和仿双酶活性（仿葡萄糖氧化酶、仿过氧化物模拟酶）的Fe3O4-Au纳米复合材料为纳米载体，实现信号双重催化放大，构建高灵敏的夹心型TB电化学适体传感器。3.目前，利用电化学和信号放大技术对MMP-2的检测少有报道。因此，我们试图将多种信号放大技术引入到检测MMP-2的电化学多肽传感器构建中。结合生物素-亲和素系统、多孔铂纳米微球（pPtNPs）的仿酶催化以及HCR放大技术，构建一种通用的信号‘on-off’型的电化学多肽传感器。通过简单的水热法，制备了具有多孔结构的pPtNPs。其作为载体不仅能提高生物分子（多肽和单链DNA）的固载量，同时自身具有良好的催化活性。修饰在纳米载体上的单链DNA能够引发HCR，产生长的双链DNA，从而将大量电活性物质Thi引入到电极表面，放大检测的电化学信号。而且，采用信号‘on-off’的检测模式，能够有效降低背景信号，提高传感器的灵敏度。10 第二章基于纳米钯修饰的石墨烯-二硫化钼花状纳米复合物和酶催化放大的凝血酶电化学适体传感器研究第二章基于纳米钯修饰的石墨烯-二硫化钼花状纳米复合物和酶催化放大的凝血酶电化学适体传感器研究2.1引言适体，是由人工筛选的寡核苷酸片段，能够以极高的亲和力与多种目标蛋白质进行特异性结合。基于适体作为分子识别元件构建的生物传感器检测方法有荧[55][56][57][58][59][60]光、化学发光、表面等离子体共振、比色、微量天平、电化学等。电化学适体传感器具有响应速度快、灵敏度高、制备相对简单、便携和成本较低等优点而备受关注。通过增大电化学响应信号以提高电化学适体传感器的灵敏度是其中的研究热点。通常用于增强电化学信号的放大技术有纳米材料放大、酶催化放大、生物放大技术等。其中纳米材料与酶催化放大技术的使用尤为广泛。酶催化放大技术的实现是通过酶催化特定底物的氧化还原反应来促进电活性物质的电子传递，放大电化学信号，从而达到提高传感器灵敏度和其它各项性能的目的。此外，由于纳米材料的种类巨多，且具有其它材料无法比拟的优越性质，为传感器的构建提供了广阔的空间。其中，具有二维结构的石墨烯由于其卓越的物理和化学特性，在生物分析中[61]备受关注。二硫化钼（MoS2），作为过渡金属二硫化物中的一员，具有与石墨烯[62]类似的层状结构，并且能够有效诱导复杂平面电子的传导。相比于石墨烯，MoS2合成方法简单且成本低廉，但单独的MoS2导电性及分散性均比石墨烯差。而研究结果证明，MoS2与其它导电的碳材料结合物表现出完美的导电性、大的比表面积[63]和优良的电化学性能等协同效果。协同效应使这些纳米复合物具有保持氧化还原探针和酶活性的能力，为构建新颖的电化学传感器提供了可能。本研究工作中，运用钯纳米修饰的PDDA功能化石墨烯-二硫化钼花状纳米材料（PdNPs/PDDA-G-MoS2）作为固载基质，结合酶催化信号放大构建一个夹心型检测TB的电化学适体传感器。通过静电吸附作用，带负电的PdNPs能够固定在带正电的PDDA-G-MoS2表面。具有大的比表面积和活性位点的PdNPs/PDDA-G-MoS2作为纳米载体能够固载大量的氧化还原探针Tb、GOD和卟啉铁/G-四链体，形成卟啉铁/G-四链体耦合的Tb-PdNPs/PDDA-G-MoS2生物偶合物（第二适体）。固载的GOD能够有效催化葡萄糖的氧化，同时产生H2O2。产生的H2O2紧接着被PdNPs和卟啉铁/G-四链体协同催化分解，大大促进Tb的电子转移速率，提高传感器的电化学信号。本实验所构建的传感器具有较宽的检测范围和较低的检测下限，为其它蛋白质的检测提供一个简单有效的方法。11 西南大学硕士学位论文2.2实验部分2.2.1实验药品与仪器氧化石墨烯（GO）购买于南京先锋纳米科技公司（中国）。二水合钼酸钠（Na2MoO4·2H2O）和聚二甲基二烯丙基氯化铵（PDDA）与北京药剂公司（中国）购买。癌胚抗原（CEA）和甲胎蛋白（AFP）购买于郑州博赛生物公司（中国）。TB、GOD、Tb、卟啉铁（hemin）、氯钯酸钾（K2PdCl4）、氯金酸（HAuCl4）、血红蛋白（Hb）、牛血清白蛋白（BSA）、L-半胱氨酸（L-cys）和人免疫球蛋白（IgG）均购置于Sigma-Aldrich公司（美国）。凝血酶适体链（TBA）：5'-NH2-(CH2)6-GGTTGGTGTGGTTGG-3'由上海生物工程有限公司（中国）合成。三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）购买于Roche公司（瑞士）。人血清样本由-1-1重庆新桥医院（中国）提供。20mmol∙L的Tris-HCl缓冲液是由1mmol∙LMgCl2，-1-1-11mmol∙LCaCl2，5mmol∙LKCl和140mmol∙LNaCl配制而成，用来稀释适体-1链。不同pH的磷酸盐缓冲液（PBS）用做测试底液，包含0.1mol∙LNa2HPO4,0.1-1-1mol∙LKH2PO4和0.1mol∙LKCl。其他药品均为分析纯，可直接使用。实验用水为二次蒸馏水。电化学测定是由CHI-660D型电化学工作站（上海辰华仪器公司，中国）完成。其中三电极体系包括辅助电极-铂丝电极，参比电极-饱和甘汞电极（SCE），工作电极-修饰的玻碳电极（GCE，Ф=4mm）。纳米材料的尺寸和形貌是由S-4800型扫描电子显微镜进行表征（SEM，日立Hitachi公司）。纳米材料的元素组成分析是由ESCALAB250型X射线光电子能谱仪进行的（XPS，英国V.G公司）。缓冲液的pH由MP230型pH计（瑞士）进行调节。2.2.2钯纳米修饰的PDDA-G-MoS2花状纳米复合物（PdNPs/PDDA-G-MoS2）制备[64]运用水热法合成PDDA功能化的石墨烯-MoS2花状纳米复合材料（PDDA-G-MoS2）。将0.0086gGO加入到10mL二次蒸馏水中，超声分散均匀，加入0.075gNa2MoO4·2H2O和75μLPDDA（20%）。超声搅拌20min后加入0.2g尿素，加入二次蒸馏水稀释至20mL后剧烈搅拌1h。将所得的溶液转移至25mL反应釜中，200ºC下加热24h。冷却至室温后，用乙醇和二次蒸馏水离心洗涤数次，将得到的产品置于60ºC下真空干燥。将5mgPDDA-G-MoS2超声条件下溶解在5mL二次蒸馏水中。接着，逐滴加-1-1入1mL10mmol∙LK2PdCl4，剧烈搅拌10min。随后，缓慢加入1mL0.1mol∙L新制备的NaBH4，剧烈搅拌30min。离心洗涤数次后，将制得的PdNPs/PDDA-G-MoS2重新分散在5mL二次蒸馏水中。为了对比材料的固载量，运用水合肼作为还原剂，制备了PDDA-还原氧化石墨烯纳米复合物（PDDA-rGO）。12 第二章基于纳米钯修饰的石墨烯-二硫化钼花状纳米复合物和酶催化放大的凝血酶电化学适体传感器研究而且，PbNPs同样通过静电吸附作用结合在PDDA-rGO上。此外，PdNPs的是在不加入固载基质的条件下，通过还原稀释的K2PdCl4制备得到。2.2.3凝血酶第二适体：卟啉铁/G-四链体耦合的Tb-PdNPs/PDDA-G-MoS2纳米复合物的制备-1-1将50μL3mmol∙LTb和100μL2.5μmol∙LTBA加入到1mLPdNPs/PDDA-G-MoS2溶液中，4ºC下搅拌过夜后。接着，加入0.5mg卟啉铁，搅拌2h后离心洗涤。加入1mgGOD孵育40min以封闭剩余的活性位点。离心洗涤后，将制备的卟啉铁/G-四链体耦合的Tb-PdNPs/PDDA-G-MoS2纳米复合物重新分散在1mLPBS（pH7.0）中。为了研究本方案中的信号放大手段，制备了其它三种纳米复合物，分别为卟啉铁/G-四链体耦合的Tb-PdNPs，TBA-PdNPs/PDDA-G-MoS2，卟啉铁/G-四链体耦合的Tb-PdNPs/PDDA-rGO。图2.1传感器构建过程以及信号放大原理Fig.2.1Schematicdiagramsofthepreparedaptasensorandthesignalamplificationmechanism.2.2.4夹心型电化学传感器的构建过程适体传感器的构建过程和相应的催化放大原理如图2.1所示。修饰之前，分别用0.3和0.05μm的Al2O3抛光粉对GCE进行打磨，在二次蒸馏水和乙醇中超声洗涤得到镜面表面。将电极浸入1mLHAuCl4（1%）中在−0.2V下进行电沉积30s，-1得到AuNPs修饰的电极（depAu/GCE）。接着，将20μL2.5μmol∙LTBA滴涂在depAu/GCE表面，4ºC下孵育16h。将20μLBSA（1%）滴涂到电极表面，室温下孵育40min，用来封闭非特异性结合位点。随后，将20μL不同浓度的TB滴涂在电极表面，室温下孵育40min。最后，将20μL制得的第二适体滴涂在修饰电极上，孵育1h使其形成夹心传感体系。13 西南大学硕士学位论文2.2.5电化学测定修饰电极的电化学行为运用循环伏安（CV）进行表征。测试在包含有5.0-13-/4--1mmol∙L[Fe(CN)6]作为氧化还原探针的1mL0.1mol∙LPBS（pH7.4）中进行，-1电压范围为−0.2到0.6V，扫描速率为100mV∙s。从0到−0.6V的差分脉冲伏安-1响应（DPV）是在1mL包含有一定浓度葡萄糖的0.1mol∙LPBS（pH7.0）中进行测定，其中调整振幅为0.05V，脉冲宽度为0.05s，取样宽度为0.0167s。2.3结果与讨论2.3.1不同纳米材料的表征GO、PDDA-G-MoS2和PdNPs/PDDA-G-MoS2纳米材料的基本形貌可从图2.2中所示的SEM表征图中得到证明。如图2.2A所示，GO具有褶皱状和可折叠的层状结构。当PDDA存在时，MoS2和石墨烯相结合形成了具有花状结构的PDDA-G-MoS2（图2.2B）。花状结构由一些薄的褶皱层组成，能够在很大程度上增加纳米材料的比表面积。从图2.2C中可以观察到大量的PdNPs结合在PDDA-G-MoS2表面，表明PdNPs/PDDA-G-MoS2的成功制备。图2.2（A）GO，（B）PDDA-G-MoS2，（C）Pb/PDDA-G-MoS2的SEM图Fig.2.2SEMimagesofGO(A),PDDA-G-MoS2(B),PdNPs/PDDA-G-MoS2(C).此外，制备的卟啉铁/G-四链体耦合的Tb-PdNPs/PDDA-G-MoS2纳米复合物的化学组成用XPS进行分析，结果见图2.3。可见，Pd3d（图2.3A）在335.78eV和341.78eV处的特征峰，Mo3d（图2.3B）在232.23eV和235.38eV处的特征峰，S2p（图2.3C）在167.83eV处的特征峰，N1s(图2.3D)在401.68eV处的特征峰。表明PDDA-G-MoS2上PdNPs的成功固载。由于卟啉铁/G-四链体结构中P和Fe的存在，纳米复合物中能够分别观察到Fe2p（图2.3E）和P2p（图2.3F）的特征峰。其中，Fe2p的峰出现在709.13eV和723.15eV处，P2p的特征峰出现在134.08eV处。以上结果证明了卟啉铁/G-四链体耦合的Tb-PdNPs/PDDA-G-MoS2纳米复合物的成功制备。14 第二章基于纳米钯修饰的石墨烯-二硫化钼花状纳米复合物和酶催化放大的凝血酶电化学适体传感器研究图2.3卟啉铁/G-四链体标记的Pb/PDDA-G-MoS2生物耦合物的X射线光电子能谱图，（A）Pd，（B）Mo,（C）S，（D）N，（E）Fe，（F）PFig.2.3XPSspectraof(A)Pd,(B)Mo,(C)S,(D)N,(E)Feand(F)Pforthepreparedhemin/G-quadruplexconjugatedTb-PdNPs/PDDA-G-MoS2.图2.4传感器构建过程的CV表征:（a）裸的GCE，（b）depAu/GCE，（c）TBA/depAu/GCE，（d）BSA/TBA/depAu/GCE，（e）TB/BSA/TBA/depAu/GCEFig.2.4CVsof(a)bareGCE,(b)depAu/GCE,(c)TBA/depAu/GCE,(d)BSA/TBA/depAu/GCE,(e)TB/BSA/TBA/depAu/GCE.2.3.2适体传感器构建过程的电化学表征-1为了观察电极组装过程中表面特征的变化，CV曲线在5.0mmol∙L3-/4-[Fe(CN)6]（pH7.4）溶液中进行测定，结果如图2.4所示。可见，裸GCE表现出一对明确的氧化还原峰（曲线a）。当在GCE表面沉积上AuNPs后，氧化还原电流明显增强（曲线b），表明AuNPs具有良好的导电性。当TBA通过Au-N键结合在电极表面后，氧化还原峰电流明显降低（曲线c），这是由于TBA阻碍了15 西南大学硕士学位论文电子传递。当BSA封闭非特异性位点后，氧化还原峰电流继续减小（曲线d）。-1此外，孵育1nmol∙LTB后，CV响应继续降低（曲线e），这是由于TB属于蛋白质，本身不导电。2.3.3实验条件的优化为了得到更高的灵敏度和选择性，对实验条件进行了优化，包括初始TBA的浓度、TB孵育时间、测试底液中葡萄糖的浓度以及测试底液的pH。将20μL浓度-1分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0μmol∙L的TBA孵育在电极表面，对应的CV-13-/4-曲线测定在1mL5.0mmol∙L[Fe(CN)6]（pH7.4）溶液中进行。如图2.5A，随-1着TBA浓度增大峰电流逐渐降低，当浓度为2.5μmol∙L时峰电流达到最小值。因-1此，TBA的最佳孵育浓度为2.5μmol∙L。图2.5TBA孵育浓度的优化（A），TB孵育时间优化（B），测试底液中葡萄糖浓度的优化（C），测试底液pH的优化（D）Fig.2.5Theeffectofdifferentexperimentparameters:(A)TBAconcentrationand(B)TBincubationtime,(C)glucoseconcentrationinPBS,(D)pHofworkingsolution.目标物TB的孵育时间是影响适体传感器性能的一个重要因素。图2.5B展示-1-13-/4-了1nmol∙LTB不同孵育时间下在1mL5.0mmol∙L[Fe(CN)6]（pH7.4）溶液中的CV响应，孵育时间分别为10、20、30、40、50min。随着孵育时间的增加，峰电流逐渐减小，当孵育时间达到40min时，峰电流达到最小值。此后，信号到达一个平台，表明适体和目标物TB之间的结合达到饱和状态。因此，夹心型反应中，选择40min为TB的最佳孵育时间。16 第二章基于纳米钯修饰的石墨烯-二硫化钼花状纳米复合物和酶催化放大的凝血酶电化学适体传感器研究测试底液中葡萄糖的含量对传感器的灵敏度和选择性具有重要的影响。图2.5C展示了在不同浓度葡萄糖的条件下适体传感器的还原峰电流（I）。孵育完1-1-1nmol∙LTB后，将传感器置于1mL含有不同量的葡萄糖（1mmol∙L，体积分别-1为25、50、75、100和125μL）的0.1mol∙LPBS中进行测定。从图中可得，I随着加入葡萄糖体积的增加而逐渐增大，当体积为100μL时达到最大值，相当于-1在PBS中的浓度为91μmol∙L。之后再加入葡萄糖，峰电流不再增加。因此，用-1于信号放大，葡萄糖的浓度为91μmol∙L效果最佳。-1测试底液的pH对适体传感器性能的影响通过测定孵育了1nmol∙LTB的修-1饰电极在不同pH的PBS（含有91μmol∙L葡萄糖）中DPV响应来进行研究，pH分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。如图2.5D所示，当在pH为7.0的PBS中进行测定时，所得的DPV信号最大。因此，选择pH为7.0PBS为测试底液。2.3.4不同信号放大策略的对比为了验证适体传感器使用PDDA-G-MoS2和卟啉铁/G-四链体作为信号放大策略的优越性，制备4种第二适体用于对比实验，包括（i）卟啉铁/G-四链体标记的Tb-PdNPs、（ii）TBA标记的Tb-PdNPs/PDDA-G-MoS2、（iii）卟啉铁/G-四链体标记的Tb-PdNPs/PDDA-rGO和（iv）卟啉铁/G-四链体标记的-1Tb-PdNPs/PDDA-G-MoS2。通过在1mLPBS（0.1mol∙L，pH7.0）检测底液中加-1入91μmol∙L葡萄糖前后的DPV电流的变化值（ΔI）来进行对比检测考察。如图2.6所示，当孵育前三种第二适体后，其中（i）不含石墨烯和MoS2、（ii）不含卟啉铁、（iii）不包含MoS2，ΔI分别为2.69、2.98、和3.42μA。相比之下，当孵育目标第二适体（iv）时，ΔI达到最大值5.35μA。上述结果归因于：（1）在PDDA-G-MoS2中引入MoS2增加了石墨烯的比表面积，制得的PDDA-G-MoS2能够增加具有电催化活性的PdNPs、卟啉铁/G-四链体和GOD的固载量，促进了电极与Tb之间的电子传递，从而实现电化学信号的放大；（2）在底液中加入葡萄糖后，固载的GOD能够快速将葡萄糖氧化，并伴随着H2O2的产生，生成的H2O2进一步被PdNPs和卟啉铁/G-四链体协同催化分解，从而放大Tb的电化学信号。2.3.5电化学适体传感器的校准曲线在最优的实验条件下，所构建的电化学适体传感器的灵敏度和线性范围是通-1过孵育一系列不同浓度TB来进行研究的。测试底液为1mL含有91μmol∙L葡萄-1糖的0.1mol∙LPBS（pH7.0）。结果如图2.7A所示，适体传感器的还原峰电流随着TB浓度的增大不断增加。如图2.7B，DPV峰电流与TB浓度的对数值在0.0001-1至40nmol∙L范围内呈现良好的线性关系。线性方程为I(μA)=−1.675lgc17 西南大学硕士学位论文-1(nmol∙L)-13.15，线性相关系数为0.994。根据LOD=3SB/m计算出检测下限为0.062-1pmol∙L，其中LOD为检测下限，SB为空白值的相对标准偏差，m为线性方程的[65-72]斜率另外，与其它文献所报道的检测TB的方法相比，本实验所构建的电化学适体传感器表现出令人满意的线性范围和检测下限（表2.1所示）。一方面，PdNPs/PDDA-G-MoS2作为纳米载体，不仅能够增大氧化还原探针和高活性酶的固载量，而且能够加速电子传递。另一方面，具有仿过氧化物模拟酶活性的卟啉铁/G-四链体和PdNPs在整个体系中起到协同催化作用，大大提高了催化效果。图2.6不同信号标记的第二适体修饰电极加入葡萄糖溶液前（a）后（b）的DPV响应Fig.2.6DPVresponsesofthedifferentsandwichformataptasensorsintheabsence(a)andinthe-1presenceof91μmol∙Lglucose(b)byusingdifferentsecondaryaptamer:(A)hemin/G-quadruplexconjugatedTb-PdNPs,(B)TBA-Tb-PdNPs/PDDA-G-MoS2,(C)hemin/G-quadruplexconjugatedTb-PdNPs/PDDA-rGO,(D)hemin/G-quadruplexconjugatedTb-PdNPs/PDDA-G-MoS2.图2.7传感器对于不同浓度TB检测的DPV响应曲线（A），传感器对TB检测的标准曲线（B）Fig.2.7DPVresponsesfordifferentconcentrationsoftargetTBfortheproposedaptasensor(A),thelinearrelationshipbetweentheDPVpeakcurrentandthelogarithmoftheTBconcentration(B).18 第二章基于纳米钯修饰的石墨烯-二硫化钼花状纳米复合物和酶催化放大的凝血酶电化学适体传感器研究表2.1构建的电化学适体传感器与其他检测TB的适体传感器性能的对比Table2.1TheperformancecomparisonofTBaptasensorsbasedondifferentmethodologiesa-1-1AnalyticalmethodsLinearrange/(nmol∙L)Detectionlimit/(pmol∙L)ReferencesColorimetry0.0025-6.21.565Fluorescence-10066EIS0.12-300.3067SPR0.1-7510068CV0.01-506.369DPV1-600.570DPV0.0073-7.34.671ECL0.005-501.772DPV0.0001-400.062OurworkaEIS:electrochemicalimpedancespectroscopy,SPR:surfaceplasmonresonance,ECL:electrochemiluminescent.2.3.6电化学适体传感器检测TB的选择性，稳定性和重现性研究电化学传感平台的选择性通过将适体传感器孵育其它干扰物质进行研究，包-1括浓度均为10nmol∙L的BSA、IgG、L-cys、Hb、CEA和AFP，并与干扰物质和-1目标物TB共存时的电流响应进行对比。测试底液均为1mL含有91μmol∙L葡萄-1糖的0.1mol∙LPBS（pH7.0）。取3次平行测定的平均值，如图2.8所示，与孵育干扰物质相比，孵育目标物TB时的响应信号最大。当干扰物与TB共存时，DPV响应信号与TB单独存在时的响应信号大致相同，表明所构建的适体传感器具有良好的选择性。图2.8电化学适体传感器的选择性研究Fig.2.8SelectivityinvestigationforTBdetectionagainstpossibleinterferents.-1适体传感器的重现性通过对比孵育1nmol∙L目标物TB的六支电极的峰电流19 西南大学硕士学位论文-1-1进行研究。测试底液为1mL含有91μmol∙L葡萄糖的0.1mol∙LPBS（pH7.0）。峰电流的相对标准偏差为5.3%，表明传感器具有良好的精密度和重现性。此外，-1通过测定孵育了1nmol∙LTB电极长时间保存在pH为7.0的PBS中的电流响应来研究所制备的适体传感器的稳定性。存储6天后的峰电流的减小值仅为初始峰电流的2.3%。当存储为10天、12天和15天后，DPV响峰电流为起始值的94.6%、93.9%和92.3%，表明适体传感器具有良好的存储稳定性。表2.2构建的传感器在人类血清中的加标回收实验n=3Table2.2DeterminationofTBaddedinhumanbloodserumwiththeproposedaptasensor-1-1SamplesAddedTB/(nmol∙L)FoundTB/(nmol∙L)Recovery/%RSD/%10.0010.001081086.320.010.0096296.27.330.10.1031035.641.00.98998.93.155.04.7995.87.42.3.7电化学适体传感器分析应用通过标准加入法对该分析方法实际应用的可行性进行分析。一系列样品通过将不同浓度的TB加入到稀释了10倍的人血清样品中制备，人血清样品取自重庆-1新桥医院。所制备的样品直接用于适体传感器测定，测试均在含有91μmol∙L葡-1萄糖的0.1mol∙LPBS（pH7.0）中进行，DPV测定的电压范围为−0.6到0V。进行3次平行测试，结果如表2.2所示，得到的回收率和相对标准偏差分别为95.8-108%，3.1%-7.4%，表明该传感器有应用于临床检测的可能性。2.4结论基于PdNPs/PDDA-G-MoS2花状纳米复合物和酶信号放大，本实验成功构建了夹心型电化学适体传感器用于TB的定量检测。通过引入MoS2，增加了石墨烯的比表面积和电子传递速率，得到的具有花状结构的PDDA-G-MoS2用来固载电化学活性的生物分子。具有大量活性位点和良好生物相容性的PdNPs/PDDA-G-MoS2能够固载大量的电子媒介体Tb、GOD和卟啉铁/G-四链体。此外，具有良好电催化活性的卟啉铁/G-四链体和PdNPs能够协同催化葡萄糖氧化伴随的产物H2O2的分解，极大程度上放大了电化学信号。而且，所制备用于检测TB的电化学传感器具有相当较低的检测下限，较宽的线性范围，良好的选择性和重现性。此方法有望扩展到其它蛋白质的检测和实际临床应用中。20 第三章基于卟啉铁/G-四链体作为信号标签和仿双酶活性的金包四氧化三铁作为纳米载体构建的凝血酶电化学适体传感器第三章基于卟啉铁/G-四链体作为信号标签和仿双酶活性的金包四氧化三铁作为纳米载体构建的凝血酶电化学适体传感器3.1引言在传感器的构建中，许多具有优良性能的纳米材料被用于增强检测信号和提高传感器的灵敏度。其中，四氧化三铁（Fe3O4）磁性纳米材料由于具有独特的超[73]顺磁性，在生物学和医学领域中广泛用于小分子检测以及蛋白质的分离和检测。[43]此外，Fe3O4还具有仿过氧化物模拟酶的性质。He等制备出单分散的二氧化硅包金-四氧化三铁介孔纳米微球（Fe3O4-Au@SiO2），并同时具有仿葡萄糖氧化酶和[74]仿过氧化物模拟酶的仿双酶活性。其中，Fe3O4-Au@SiO2表面极小的AuNPs作为仿葡萄糖氧化酶，能够在溶解氧的存在条件下将葡萄糖氧化，同时产生H2O2。接着，Fe3O4作为仿过氧化物模拟酶能够继续催化H2O2的分解。与传统的蛋白酶分子相比，具有仿双酶活性纳米复合材料具有合成成本低、稳定性好、抗水解性强等优点，有望应用于无酶型的电化学传感器构建。许多氧化还原探针被用在电化学传感器的构建中，用来产生可检测的电化学[75-76]信号，包括Tb、Thi、MB、Fc等。其中，卟啉铁，作为过氧化氢酶的辅因子，[48]也能够产生电化学信号而被作为氧化还原介质用于电化学传感器的构建。此外，卟啉铁能够嵌入富含G碱基的单链DNA中，形成具有仿过氧化物模拟DNA酶活性和独特结构的卟啉铁/G-四链体。相比于传统的电活性物质的使用，卟啉铁/G-四链体作为电活性物质具有操作简便、易于标记、稳定性好等优点，且可作为DNA模拟酶催化放大电化学信号，达到进一步提高传感器灵敏度的效果。本实验中，利用具有仿双酶性质的Fe3O4-Au纳米复合材料和具有电化学活性的卟啉铁/G-四链体作为信号增强剂，设计了无酶的电化学适体传感器用于TB的检测。利用Au与氨基终端的凝血酶适体链（NH2-TBA）上的氨基强的结合作用，具有大的比表面积和仿双酶性质的Fe3O4-Au纳米复合物能够用来固载大量的第二适体链（NH2-TBAII）。接着，将卟啉铁嵌入富含G碱基的NH2-TBAII形成卟啉铁/G-四链体共轭的Fe3O4-Au复合物（第二适体）。目标蛋白质TB通过夹心的形式结合在第一适体链（NH2-TBAI）和第二适体中间。在葡萄糖存在的条件下，Fe3O4-Au纳米复合材料表面的Au能够催化葡萄糖氧化，同时将水中溶解的O2还原为H2O2。Fe3O4-Au中的Fe3O4核和卟啉铁/G-四链体能够协同催化H2O2的分解，从而促进卟啉铁的电子转移，实现电化学信号的放大。该传感器运用具有仿双酶性质的Fe3O4-Au纳米复合材料作为纳米载体以及同时具有电化学和电催化活性作21 西南大学硕士学位论文为信号标签，能够避免其它酶分子和电活性物质的引入，能够简化传感器的制备过程，减低制备成本。实验结果证明，该传感器具有良好的选择性、稳定性和灵敏度，为构建简单、灵敏的检测其它种类的蛋白质提供了新的方法。3.2实验部分3.2.1实验药品与仪器TB、L-cys、HAuCl4、BSA和IgG均购于Sigma-Aldrich公司（USA）。凝血酶适体链（NH2-TBA，序列为：5'-NH2-(CH2)6-GGTTGGTGTGGTTGG-3'购买于生工生物工程有限公司（上海）。柠檬酸钠、NaBH4、醋酸钠（NaAc）、三氯化铁（FeCl3）和乙二醇在成都科龙化学公司（中国）购买。Tris购于Roche公司（Switzerland）。葡萄糖购于Sinopharm公司（中国），人血清样本取自重庆市第九人民医院。利用CHI660D型电化学工作站（中国上海辰华）对制备的电化学适体传感器的修饰过程和分析性能进行测试。3.2.1Fe3O4-Au纳米复合材料的合成[74]采用水热法合成Fe3O4-Au纳米复合材料。将0.70g的FeCl3和0.28g的柠檬酸钠分散在20mL的乙二醇中，在搅拌的条件下加入1.2g的NaAC，让其充分混合，得到均匀的黄色溶液。转移到高压反应釜中，在200ºC的条件下反应10h。冷却到室温后，通过磁性分离得到黑色产物，接着用乙醇和氮气饱和的二次蒸馏水交替洗涤产物，除去其中的柠檬酸钠和乙二醇等杂质。分离出的黑色产物在60ºC的真空干燥箱中干燥过夜，得到Fe3O4纳米材料。在25mL氮气饱和的二次蒸馏水中加入20mg的Fe3O4，超声处理5分钟。待其分散均匀后，在搅拌的条件下加入405µL1%的HAuCl4溶液。接着，将新配制-1的1mL0.15mol∙L的NaBH4缓慢加入到溶液中，剧烈搅拌30min。通过静电作用，还原得到的AuNPs固载在Fe3O4粒子表面，从而生成Fe3O4-Au纳米复合材料。磁性分离，并用氮气饱和的二次水洗涤产物数次。最后将制得的Fe3O4-Au纳米复合材料在分散在PBS中。3.2.2凝血酶第二适体：卟啉铁/G-四链体标记的Fe3O4-Au生物纳米复合材料的制备-1首先，将60µL100nmol∙LNH2-TBAII加入到1mLFe3O4-Au溶液中，4ºC下缓慢搅拌过夜。通过Au-N键，将NH2-TBAII固载在Fe3O4-Au纳米复合物表面。接着，将0.5mg卟啉铁加入到上述溶液中搅拌40min形成卟啉铁/G-四分体结构。接着将200µLBSA的水溶液（1%）加到上述混合物中搅拌40min，用来封闭剩22 第三章基于卟啉铁/G-四链体作为信号标签和仿双酶活性的金包四氧化三铁作为纳米载体构建的凝血酶电化学适体传感器余的活性位点，最终制得卟啉铁/G-四链体标记的Fe3O4-Au生物纳米复合材料。最后，离心洗涤分散在Tris-HCl缓冲液，在4ºC条件下保存备用。为了证明Fe3O4-Au优越的催化性能，在没有Fe3O4存在的条件下，用类似的方法制备了卟啉铁/G-四链体标记的Au生物纳米复合材料。5nmAuNPs是根据报[77]道文献，以柠檬酸钠为稳定剂、NaBH4为还原剂制得：1mL的HAuCl4（1%）-1溶液和2mL0.03mol∙L的柠檬酸钠溶液搅拌的条件下加入到50mL二次蒸馏水-1中。接着，加入1mL0.1mol∙L新制备的NaBH4溶液，室温下放置2h。离心洗涤后，将制得的AuNPs分散在1mLPBS中备用。图3.1电化学适体传感器（A）以及第二适体（B）的制备过程。传感器孵育第二适体后在不-1含（I0）和含有（I）葡萄糖的1mLPBS（0.1mol∙L，pH7.0）中的DPV响应曲线Fig.3.1Thepreparedprocedureoftheelectrochemicalaptasensor(A)andthesecondaryaptamer(B).(C)DPVcuresoftheproposedaptasensorafterincubationwiththesecondaryaptamerbefore-1andafteraddingglucosein1mLPBS(0.1mol∙L,pH7.0).3.1.5夹心型电化学传感器的构建过程夹心型适体传感器的构造过程如图3.1所示。首先，分别用0.3µm和0.05µm的Al2O3粉末对裸GCE进行打磨，在蒸馏水中超声清洗。将预处理后的电极放入1mLHAuCl4溶液（1%），在–0.2V恒电位下沉积纳米金（dep-Au），沉积时间为-130s。滴加20µL0.25µmol∙L的NH2-TBAI于电极表面，4ºC下孵育16h。接着，将20µLBSA溶液（1%）滴涂到电极表面并孵育40min，以封闭剩余的活性位点。每支电极分别滴加20µL的不同浓度的TB标准溶液，室温下孵育40min。最后，将20µL第二适体滴加到电极表面，室温下孵育1h。得到的修饰电极用于随后的用于电化学测定。23 西南大学硕士学位论文3.3实验结果与讨论3.3.1Fe3O4纳米粒子和Fe3O4-Au纳米复合物的SEM表征图3.2分别为Fe3O4纳米粒子和Fe3O4-Au纳米复合物的SEM表征图。从图3.2A可以清楚的看出Fe3O4纳米粒子呈球状，而且有一个粗糙的表面，直径大约为250-300nm。如图3.2B所示，合成得到的Fe3O4-Au粒子中，许多小尺寸的AuNPs均匀分布在Fe3O4表面。以上SEM表征表明Fe3O4纳米粒子和Fe3O4-Au纳米复合材料的成功制备。图3.2（A）Fe3O4纳米粒子，（B）Fe3O4-Au纳米复合物的SEM图Fig.3.2SEMimagesofFe3O4nanoparticles(A)andFe3O4-Aunanocomposites(B).图3.3适体传感器构建过程的CV表征：GCE（a）、depAu/GCE（b）、NH2-TBAΙ/depAu/GCE（c）、BSA/NH2-TBAΙ/depAu/GCE（d）、TB/BSA/NH2-TBAΙ/depAu/GCE（e）Fig.3.3CVsofthestepwisemodifiedaptasensor:(a)GCE;(b)depAu/GCE;(c)NH2-TBAΙ/depAu/GCE;(d)BSA/NH2-TBAΙ/depAu/GCE;(e)TB/BSA/NH2-TBAΙ/depAu/GCE.3.3.2适体传感器构建过程的电化学表征利用CV对适体传感器制备过程进行了电化学表征。CV曲线在1mL5.0-13-/4--1mmol∙L[Fe(CN)6]（pH7.4）扫速为100mVs的条件下测得。如图3.3所示，3-/4-GCE在[Fe(CN)6]溶液中有一对很好的氧化还原峰（曲线a）。在HAuCl4溶液（1%）24 第三章基于卟啉铁/G-四链体作为信号标签和仿双酶活性的金包四氧化三铁作为纳米载体构建的凝血酶电化学适体传感器中电沉积纳米金，修饰后的电极所对应的峰电流明显增加（曲线b），这是由于AuNPs具有良好的导电性。在电极表面孵育NH2-TBA后，峰电流急剧下降（曲线c)，证明NH2-TBAI的成功修饰。孵育BSA后，由于BSA为生物大分子，能够阻-1断电子的转移，峰电流继续下降（曲线d）。孵育了5nmol∙L的目标物TB后，峰电流进一步下降（曲线e），降至最低，这表明TB与NH2-TBAI间的成功特异性结合。3.3.3实验条件的优化为了提高传感器的灵敏度及选择性，我们对实验条件进行了优化，如NH2-TBAΙ的孵育浓度，目标物TB孵育时间和测试底液中葡萄糖的浓度。将20μL含不同-13-/4-浓度的NH2-TBAΙ修饰到电极表面，并置于1mL5.0mmol∙L[Fe(CN)6]溶液（pH7.4）中进行CV测定。NH2-TBAΙ的孵育浓度分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、-13.0µmol∙L。如图3.4A所示，随着NH2-TBAΙ浓度的增加峰电流逐渐减小，并在-1NH2-TBAΙ浓度为2.5µmol∙L达到一个平台。因此，本实验选择NH2-TBAΙ的孵-1育浓度为2.5µmol∙L。目标物孵育时间之间影响目标物TB与适体的结合效率，因此对传感器的性能-1具有重要影响。我们用5nmol∙LTB标准溶液对电极进行修饰，测定不同时间下-13-/4-电极的CV响应信号，测试底液为1mL5.0mmol∙L[Fe(CN)6]溶液（pH7.4），实验结果如图3.4B所示。孵育时间在10-40min范围内时，电化学响应信号随着TB孵育时间的增长而逐渐减小。当孵育时间为40min时，峰电流达到了最小值。固本实验选择TB的孵育时间为40min。图3.4实验条件的优化：TBAΙ孵育浓度的优化（A），TB孵育时间优化（B），测试底液中葡萄糖浓度的优化（C）Fig.3.4Theoptimizationofexperimentalparameters:(A)TBAconcentration,(B)TBincubationtimeand(C)glucoseconcentration.测试底液中葡萄糖的浓度直接影响到传感器的电催化效果。适体传感器进行夹-1-1心反应以后将其置于1mLPBS（0.1mol∙L，pH7.0）中，加入不同量体积1mmol∙L的葡萄糖溶液后进行DPV曲线的测定（加入的体积分别为10、20、30、40、50、-160μL），其中孵育的TB的浓度为5nmol∙L。如图3.4C所示，随着葡萄糖量增加，25 西南大学硕士学位论文峰电流逐渐增大，并在葡萄糖溶液为100µL时达到最大值（相当于葡萄糖在PBS-1-1中的浓度为40μmol∙L）。因此，本实验选择葡萄糖浓度为40μmol∙L的PBS作为测试底液。3.3.4适体传感器的电化学行为以及卟啉铁的电子转移研究本实验的电化学信号放大是由Fe3O4-Au纳米复合物及卟啉铁/G-四链体共同-1催化完成的。为了证明仿双酶逐级放大策略的可行性，将修饰有5nmol∙LTB的-1电极置于1mL0.1mol∙LPBS（pH7.0）中，在最优的实验条件下进行DPV测定。如图3.5A所示，当适体传感器只孵育TB而不孵育第二适体时，检测不到化学信号（曲线a）。然而，当孵育上第二适体完成夹心免疫反应后，适体传感器的响应信号增加（曲线b），表明第二适体的成功修饰。在测试底液中加入葡萄糖后，可以观察到适体传感器的电流响应信号明显增强（曲线c）。本方案能够实现信号的有效增强，是由Fe3O4-Au纳米复合材料和卟啉铁/G-四链体的协同催化逐级催化实现的。首先，Fe3O4-Au纳米复合材料表面的AuNPs能够有效的催化葡萄糖的氧化，并在水中溶解O2的存在下，生成H2O2。接着，Fe3O4-Au纳米复合材料中的Fe3O4和卟啉铁/G-四分体又可同时作为过氧化氢模拟酶，进一步催化生成的H2O2的分解。上述方法促进了卟啉铁/G-四链体中卟啉铁氧化还原过程的电子传递，从而实现电化学信号的逐级催化放大。上述结果证明本实验的放大策略是可行的。图3.5（A）适体传感器信号放大策略验证:（a）为没有孵育第二适体，（b）和（c）分为孵育了第二适体在有无葡萄糖存在下的DPV信号；（B）卟啉铁电子传递验证：(a)为孵育了NH2-TBAII标记的Fe3O4-Au生物偶合物，(b)为孵育了卟啉铁/G-四分体标记的Fe3O4-Au生物偶合物Fig.3.5DPVcurvesoftheaptasensorindifferentconditions:(a)withoutsecondaryaptamer;(b)withsecondaryaptamerwithoutaddingglucoseand(c)withsecondaryaptamerafteraddingglucose.(B)DPVcurvesoftheaptasensorincubatedwithtwonanocompositesof(a)NH2-TBAIIlabelledFe3O4-Au,(b)hemin/G-quadruplexconjugatedFe3O4-Au.为了研究卟啉铁的电子传递，分别合成卟啉铁/G-四链体标记的Fe3O4-Au生物纳米复合材料以及凝血酶适体链标记的Fe3O4-Au生物纳米复合材料进行实验对26 第三章基于卟啉铁/G-四链体作为信号标签和仿双酶活性的金包四氧化三铁作为纳米载体构建的凝血酶电化学适体传感器-1比。传感器孵育目标物的浓度均为5nmol∙L。DPV响应曲线均是在1mL含有40-1-1μmol∙L葡萄糖的PBS（0.1mol∙L，pH7.0）中测得。如图3.5B所示，当适体传感器孵育凝血酶适体链标记的Fe3O4-Au生物纳米复合材料时，测得的DPV曲线没有明显的还原峰存在（曲线a）。然而，当传感器孵育卟啉铁/G-四链体标记的Fe3O4-Au生物纳米复合材料时，测得的响应曲线有明显的还原峰存在（曲线b）。上述结果表明，实验所测得的电化学信号源于卟啉铁的电子转移。3.3.5两种不同第二适体的电化学信号放大效果的对比本实验中，Fe3O4纳米粒子具有良好的磁性和仿过氧化氢模拟酶的优点，且作为核用来固载大量的具有仿葡萄糖氧化酶活性的AuNPs。当检测池中加入葡萄糖后，AuNPs能够在溶解氧存在的条件下将葡萄糖氧化为葡萄糖酸酐，同时伴随着H2O2的生成。产生的H2O2又被Fe3O4核催化分解生成O2，使仿酶体系能够有效的进行。具有大的比表面积和导电性的AuNPs能够固载大量的卟啉铁/G-四链体，从而实现TB的放大检测。图3.6孵育不同第二适体时传感器在加入葡萄糖之前（a）和之后（b）的DPV响应：（A）为孵育了卟啉铁/G-四链体标记的Au生物偶合物，（B）为孵育了卟啉铁/G-四链体标记的Fe3O4-Au生物偶合物Fig.3.6DPVcurvesofthedifferentsandwichformataptasensorintheabsence(a)andpresence(b)-1of40μmol∙Lglucosebyusingdifferentsecondaryaptamer:hemin/G-quadruplexconjugatedAu(A),hemin/G-quadruplexconjugatedFe3O4-Au(B).为了进一步证明合成的Fe3O4-Au纳米复合材料对信号放大的作用，本实验使用了两种不同的第二适体，分别为卟啉铁/G-四链体标记的Au生物纳米复合材料、卟啉铁/G-四链体标记的Fe3O4-Au生物纳米复合材料。DPV响应曲线a和b分别-1为在1mL0.1mol∙LPBS（pH7.0）加入葡萄糖催化之前和之后测得。如图3.6A所示，当适体传感器孵育卟啉铁/G-四链体标记的Au生物纳米复合材料时，测得的较小的还原峰电流和较少的电流增加值（0.87μA），表明小尺寸AuNPs的固载能力和对葡萄糖的催化性能较弱。然而，当适体传感器孵育卟啉铁/G-四链体标记27 西南大学硕士学位论文的Fe3O4-Au生物纳米复合材料时，能够测得较大的差分脉冲信号和较高的电流增加值（3.55μA，图3.6B）。这是由于Fe3O4-Au纳米复合材料具有大的比表面积和优越的催化性能。上述结果表明，本实验所采用的第二适体能够显著地放大检测信号。运用具有良好导电性、仿葡萄糖氧化酶和仿过氧化物模拟酶活性的Fe3O4-Au纳米复合材料能够固载大量的卟啉铁/G-四链体，并且能够增强卟啉铁/G-四链体的催化性能。3.3.6电化学适体传感器的校准曲线首先用不同浓度的目标物TB孵育适体传感器，分别测定各传感器在1mL含有40μmol∙L-1葡萄糖的PBS（0.1mol∙L-1，pH7.0）中的DPV响应信号，并考察峰电流与TB浓度间的关系。其中，目标物TB的浓度分别为0、0.0001、0.001、-10.01、0.1、1、5和20nmol∙L。图3.7A所代表的是DPV信号随TB浓度变化的响应曲线。当TB的浓度为0时，DPV响应信号很弱，表明实验中的非特异性结合基本可以忽略不计。随着TB浓度的增加，DPV的峰电流值响应信号逐渐增强。电流响应信号I和TB浓度的对数值呈线性关系，线性方程为I(μA)=−0.919lgc-1-1(nmol∙L)-9.028，其中检测下限为0.013pmol∙L（LOD=3sB/m，sB为空白值的相对标准偏差，m为线性方程的斜率），线性相关系数R为0.993（图3.7B）。我们将本文构建的凝血酶适体传感器与之前的工作进行对比（表3.1所示），本实验具有较低的检测下限和较宽的检测范围。这是由于实验运用具有大表面积和仿双酶性质的Fe3O4-Au纳米复合物为固载平台，能够固载大量的具有仿酶性质和电化学活性的卟啉铁/G-四链体。通过具有仿双酶性质的Fe3O4-Au纳米复合物的逐级催化作用，能够实现电化学信号的放大，扩宽传感器的检测范围，降低目标物的检测下限。图3.7（A）适体传感器对不同浓度的TB的DPV响应曲线；（B）适体传感器DPV峰电流与浓度间的线性校准曲线Fig.3.7(A)DPVresponsesoftheaptasensorincubatedwiththrombinofdifferentconcentration;(B)Thecalibrationcurveoftheaptasensor.28 第三章基于卟啉铁/G-四链体作为信号标签和仿双酶活性的金包四氧化三铁作为纳米载体构建的凝血酶电化学适体传感器表3.1构建的适体传感器与其他方法检测TB的适体传感器性能的对比Table3.1PerformancecomparedwithotherdetectionmethodologiesforTBdetectionaAnalyticalmethodsLinearrangeDetectionlimitReferences-1-1EIS0.15-18nmol∙L0.02nmol∙L78-1Flouresence-20pmol∙L79-1-1CV0.01-50nmol∙L6.3pmol∙L69-1-1QCM0.5-13nmol∙L0.1nmol∙L80-1-1ECL0.005-50nmol∙L1.7pmol∙L81-1-1Colorimetry1-100nmol∙L1nmol∙L82-1-1DPV0.0001-20nmol∙L0.013pmol∙LOurworkaQCM:Quartzcrystalmicrobalance.3.3.7电化学适体传感器检测TB的选择性，稳定性和重现性研究-1为了考察该电化学适体传感器的选择性，选择浓度均为50nmol∙L的IgG、-1BSA、L-cys等可能存在干扰的物质作为研究对象，与5nmol∙L的目标物TB的-1-1DPV信号进行对比。1mL含有40μmol∙L葡萄糖的PBS（0.1mol∙L，pH7.0）作为检测底液。如图3.8所示，当制备的传感器孵育干扰物质时，没有显著的差分脉冲伏安响应信号。此外，将IgG、BSA和L-cys同时加入到TB中并孵育到电极表面，测得的差分脉冲伏安响应信号与单独的TB相比没有明显的变化，说明构建的电化学适体传感器用于TB的检测具有良好的选择性。图3.8电化学适体传感器的选择性研究Fig.3.8Selectivityevaluationoftheaptasensordetection.为了检测电化学传感器的重现性，同时准备6支电极，在相同的实验条件下-1-1孵育5nmol∙L的TB。DPV信号均在1mL含有40μmol∙L葡萄糖的PBS（0.1-1mol∙L，pH7.0）中测得。结果显示，所有的电极都表现出大致相同的电化学响应29 西南大学硕士学位论文信号，相对标准偏差为4.3%，表明该传感器具有良好的重现性。传感器的稳定性是将制备的电极长期贮存，通过检测电化学信号的变化进行考察。将制备的电化-1学传感器在4ºC下储存15天后，并在1mL含有40μmol∙L葡萄糖的PBS（0.1-1mol∙L，pH7.0）中测试其电化学响应信号，测的结果为初始响应信号的92.3%，表明该电化学生物适体传感器对于凝血酶的检测具有良好的稳定性。3.3.8电化学适体传感器的初步应用为了检验本方案所制备的传感器对凝血酶的检测是否具有可靠性和可行性，我们将不同浓度的凝血酶加入到稀释十倍的血清样品中来制备一系列样品。接着，将这些制备好的样品用于适体传感器，并在相同的实验条件下进行检测，结果如-1表3.2所示。DPV测试在1mL含有40μmol∙L葡萄糖的PBS（pH7.0）中进行，取3次测定的平均值。所得到的回收率和相对标准偏差范围分别为94.5%-110%和3.9%-7.3%，表明该传感器在临床上有希望用于蛋白质的检测。表3.2构建的适体传感器在实际血清样品中的加标回收实验n=3Table3.2DeterminationofTBaddedinhumanbloodserumwiththeproposedaptasensor-1-1SamplesAddedTB/(nmol∙L)FoundTB/(nmol∙L)Recovery/(%)RSD/(%)10.010.0111105.620.10.09797.06.431.01.051053.945.05.091027.3520.018.994.56.23.4结论本实验利用具有仿双酶性质的Fe3O4-Au纳米复合物和卟啉铁/G-四链体作为信号放大策略，成功的构建了无酶型适体传感器用于TB的定量检测。首先，生物相容性良好的Fe3O4-Au纳米复合材料作为纳米载体，具有良好的仿葡萄糖氧化酶的活性，能够催化葡萄糖的氧化，同时生成高浓度的H2O2。此外，具有仿过氧化物模拟酶活性的Fe3O4-Au和卟啉铁/G-四链体能够进一步催化H2O2的分解，从而促进卟啉铁的电子转移，提高传感器的灵敏度。该传感器运用了具有仿双酶活性的Fe3O4-Au纳米复合材料作为纳米载体、同时具有电化学和电催化活性的卟啉铁/G-四链体作为信号标签，避免了其它酶分子和电活性物质的引入，简化了传感器的制备过程。制备的传感器具有良好的性能，包括较宽的线性范围、较低的检测下限和良好的选择性。30 第四章基于目标物诱导多肽剪切的信号‘on-off’型的多肽传感器用于基质金属蛋白酶-2检测第四章基于目标物诱导多肽剪切的信号‘on-off’型的多肽传感器用于基质金属蛋白酶-2检测4.1引言MMP-2与一些人类肿瘤息息相关，发展快速、灵敏的方法定量检测MMP-2，在临床早期诊断与肿瘤治疗有着重要的意义。当前，检测MMP-2的常见方法有免[83][84]疫分析法和明胶酶谱法。但两者都存在着缺点，前者价格昂贵复杂，后者只适用于定性分析而不能用于定量分析。多肽作为一种由肽键连接成的短链肽，具有分子量小、制备简单、合成价格较低、可反复使用和长期保存等优点。而且，[85-86]具有Pro-Leu-Gly-Val-Arg特殊序列的多肽能够被MMP-2特异性识别并剪切，为构建信号‘on或off’型检测MMP-2的传感器提供了可能。基于多肽作为分子识别元件构建的用于检测MMP-2生物传感器的检测方法大多为荧光而电化学较少。由于电化学方法具有成本低、灵敏度高、操作简便、分析速度快等优点，可以将电化学分析方法与多肽相结合构建灵敏的电化学多肽生物传感器用于MMP-2的检测。根据电化学信号的升高或者减低，传统的电化学生[87-89]物传感器往往只关注于信号‘on’或‘off’策略，产生的假阳性电化学信号[90]会带来不可忽略的背景信号，从而影响传感器的灵敏度和选择性。结合信号‘on-off’策略，能够使构建的传感器具有高灵敏度、高选择性和较低的背景信号。本文结合信号‘on-off’策略、HCR及纳米材料催化放大，构建基于目标物诱导多肽剪切检测MMP-2的信号‘on-off’型电化学多肽传感器。首先设计标记了生物素且能够被MMP-2特异性识别的多肽P1[91]（biotin-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-Gly-Gly-Cys）。利用Pt-N键和Pt-S键，多孔铂纳米（pPtNPs）被用来固载P1和单链DNA1（S1），得到生物耦合物[93]S1-pPtNPs-P1纳米探针。通过生物素与亲和素的特异性识别作用，将S1-pPtNPs-P1纳米探针固载在电极表面。当S1和S2同时存在时，HCR被引发产生双链DNA（dsDNA）。生成的dsDNA能够嵌入大量的带正电的Thi，从而产生电化学信号。当存在H2O2时，具有大比表面积和高孔容的pPtNPs能够有效催化H2O2的分解，大大促进Thi的电子传递，此时为信号‘on’状态。孵育目标物过后，标记有pPtNPs的多肽在Gly和Val之间被剪切，大量的Thi和pPtNPs从电极表面脱离，造成电化学信号的急剧降低，此时为信号‘off’状态。结合信号‘on-off’、HCR和pPtNPs催化放大策略，本实验所构建的多肽传感器具有较高的灵敏度，为其它检测蛋白酶的多肽传感体系提供了一个新的检测模式。31 西南大学硕士学位论文4.2实验部分4.2.1实验药品与仪器氯铂酸（H2PtCl6）、HAuCl4、TB、BSA、L-cys、Thi和IgG均购于Sigma-Aldrich公司（美国）。抗坏血酸（AA）、葡萄糖、NaBH4均购置于成都科龙化学公司（中国）。链霉亲合素（SA）于上海华蓝化工科技有限公司（中国）购买。MMP-2购买于北京义翘生物公司（中国）。MMP-2对应的多肽以及DNA寡核苷酸链（S1和S2）均由上海生物工程有限公司合成，序列如下：多肽（P1）：Biotin-Gly-Pro-Leu-Gly-Val-Arg-Gly-Lys-Gly-Gly-CysS1:5'-NH2-TGACATTTGCTCGATTCCTATACGAGTGGCTATCTTTCGTCTAATTGGCACGATATGTCG-3'S2:5'-ACGAAAGATAGCCACTCGTATTCATCACTGGACCGATACGCGACATATCGTGCCAATTAG-3'-1-1-1由50mmol∙LTris、10mmol∙LCaCl2,150mmol∙LNaCl和0.05%Brij35配制成的TCNB溶液用于电极的清洗。50mL非变性聚丙烯酰胺凝胶（16%）是由26.5mL聚丙烯酰胺溶液（30%），53.3mL10×TBE缓冲液，21.3mL的二次蒸馏水，26.7μLTEMED和267μL的过硫酸铵溶液（10%）配制而成。CV和DPV均由CHI-1040C电化学工作站（上海辰华仪器公司）测定。H600型透射电子显微镜(TEM，JEM1200EX，日本Hitachi公司)。4.2.2杂交链式反应（HCR）的凝胶电泳表征由单链DNAS1和S2引发的HCR由聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征。首先，º将S1，S2，由S1和S2混合从而引发HCR的三种DNA链95C下加热2min，然后迅速冷却至室温。分别将8μL的样品加入到2μL的载样缓冲中，混合均匀后加入新制备的非变性的聚苯酰胺胶体（16%），电压为100V下进行电泳分离，时间为1h后停止。罗丹明B染色后，将胶转移至暗处，在紫外灯的照射下用数码相机拍下电泳图。4.2.3多孔铂（pPtNPs）的制备[92]-1根据文献，将50μLNaOH（1.0mol∙L）和3mL新制备的抗坏血酸（10-1-1mmol∙L）依次加入到2mL二次蒸馏水中。接着，加入4mLH2PtCl6（2mmol∙L），搅拌1min后，置于60ºC下反应1h。离心洗涤数次后，将制得的pPtNPs重新分散在2mL二次蒸馏水中。为了对比不同材料的催化性能，非多孔的铂纳米颗粒-1（PtNPs）由以下步骤制得。将400μLH2PtCl6(2mmol∙L)加入到2mL二次蒸馏32 第四章基于目标物诱导多肽剪切的信号‘on-off’型的多肽传感器用于基质金属蛋白酶-2检测-1水中，接着逐滴加入1mL新制备的NaBH4溶液（0.1mol∙L）。剧烈搅拌1h，离心洗涤数次后，将制得的PtNPs重新分散在2mL二次蒸馏水中。4.2.4S1-pPtNPs-P1纳米探针的制备-1-150μLP1（25μmol∙L）和200μLS1（2.5μmol∙L）加入到1mLpPtNPs溶液º中，4C下搅拌12h。接着，将50μLBSA（1%）加入到上述溶液，搅拌40min用来封闭pPtNPs剩余的活性位点。通过离心洗涤数次可以将未结合的P1，S1和ºBSA。最后将制备的S1-pPtNPs-P1纳米探针重新分散在PBS中4C下备用。同时，为了验证所提议的纳米材料放大的信号‘on-off’型多肽传感器的性能最优，运用相似的方法制备其他两种纳米探针：Thi-pPtNPs-P1和S1-PtNPs-P1。前一种由pPtNPs、P1和Thi在没有S1的条件下制备得到，后者由PtNPs、S1和P1制备得到。图4.1信号‘on-off’型电化学多肽传感器的构建过程和检测原理，I0和I分别代表传感器孵育目标物之前和之后的DPV响应信号Fig.4.1Preparationprocessofthe‘signalon-off’electrochemicalpeptidebiosensorforMMP-2andthedetectionprinciple.I0andIwereDPVpeakcurrentoftheproposedbiosensorbeforeandafterincubationwithMMP-2.4.2.5电化学传感器的制备过程实验前，首先将GCE用0.3和0.05μmAl2O3抛光粉进行打磨，然后用二次蒸馏水和乙醇超声清洗，在空气中晾干。处理干净的GCE放入2mLHAuCl4（1%）-1中，在–0.2V下恒电位沉积30s（depAu/GCE）。接着，将10μLSA（2.0mg∙mL）33 西南大学硕士学位论文滴涂到电极表面孵育12h，然后，将20μLS1-pPtNPs-P1滴涂到电极表面孵育40-1-1-1min。接着，将20μL含有2.5μmol∙LS1、2.5μmol∙LS2和1.0mmol∙LThi的溶液滴涂在电极表面孵育2h，从而引发HCR形成带有负电的dsDNA，带正电的Thi能够嵌入双链DNA中。最后，将20μL不同浓度的MMP-2滴涂到电极表面，37°C下孵育2h。传感器的逐步制备过程和检测机理如图4.1所示。4.3结果与讨论4.3.1不同纳米材料的表征pPtNPs和S1-pPtNPs-P1的SEM表征图如图4.2和4.3所示。从图4.2A可以看出，制备的pPtNPs具有球状结构，并且其表面是粗糙和多孔的。从图4.2C中的TEM表征图可以进一步证明所制备的pPtNPs具有多孔的结构。此外，根据图4.3A中所示的材料TEM表征图的分布状况，绘制出所制备的pPtNPs的尺寸分布直方图（图4.3B）。粒子的尺寸分布于与正态分布类似，大部分pPtNPs的尺寸在54.4nm到67.2nm之间。另外，根据纳米材料连接蛋白质或其它生物分子后表面形态的不同，SEM表征可以用来证明纳米材料表面生物分子的成功固载。当pPtNPs表面固载上S1和P1时，在图4.3B中可以看出其具有模糊的表面，证明S1和P1在其表面的成功固载。图4.2pPtNPs（A）、P1-pPtNPs-S1（B）的SEM表征图，pPtNPs的TEM表征图（C），修饰了P1和S1的pPtNPs的XPS能谱图（D）Fig.4.2SEMofthepreparedpPtNPs(A)andP1-pPtNPs-S1(B).TEMofthepreparedpPtNPs(C).XPSspectraofpPtNPsimmobilizedwithS1andP1(D).为了进一步证明S1和P1的成功固载，X射线电子能谱（XPS）用来进行复合物化学元素组成的分析，图4.2D为复合物总的XPS能谱图，图4.4为各个元素区域的XPS能谱图。如图4.4A所示，Pt4f的特征峰位于71.5和74.7eV，证明pPtNPs34 第四章基于目标物诱导多肽剪切的信号‘on-off’型的多肽传感器用于基质金属蛋白酶-2检测的存在。在401.3、285.1和532.4eV处出现的特征峰来自于生物分子中N1s、C1s和O1s的存在（分别为图4.4B、C和D）。在168.5eV处出现S2p的特征峰主要来源于P1（图4.4E）。另外，由于S1中P元素的存在，故能检测到P2p在133.3eV处的特征峰（图4.4F）。上述结果进一步证明pPtNPs表面P1和S1的成功固载。图4.3pPtNPs的TEM表征图（A）和尺寸分布图（B）Fig.4.3TEMimageofpPtNPs(A)andthesizedistributinghistogramofpPtNPs(B).图4.4修饰了P1和S1的pPtNPs中各个元素的XPS能谱图：（A）Pt4f区域，（B）N1s区域，（C）C1s区域，（D）O1s区域，（E）S2p区域，（F）P2p区域Fig.4.4XPSspectraofpPtNPsimmobilizedwithS1andP1:Pt4fregion(A),N1sregion(B),C1sregion(C),O1sregion(D),S2pregion(E),P2pregion(F).4.3.2制备的传感器的电化学表征利用CV对传感器的制备过程的电化学行为进行表征，结果如图4.5所示。电-13-/4-极修饰过程的前三步CV表征是在1mL5mmol∙L[Fe(CN)6]（pH7.4）溶液中-1进行，扫描速率为100mV∙s。图4.5A中，电极沉积AuNPs后（曲线b），得到比裸的GCE（曲线a）更大的氧化还原峰，表明AuNPs能够促进电子转移。接着，当SA结合在电极表面时，响应电流明显降低（曲线c），这是由于SA不导电阻碍-1了电子传递。余下的电极修饰过程表征是在1mL0.1mol∙LPBS（pH7.0）中进行。35 西南大学硕士学位论文如图4.5B，当S1-pPtNPs-P1纳米探针修饰在电极表面上时，没有明显的氧化还原峰（曲线d），这是由于缺少电活性物质的存在。孵育过S1、S2和Thi的混合物后，检测到明显的氧化还原峰（曲线e），这是由于S1和S2能够引发HCR，生成的-1DNA双链能够引入大量的电活性物质Thi。随后，当孵育完100pg∙mLMMP-2后，响应电流明显减低，这是由于MMP-2能够特异性识别并且对其进行剪切，电活性物质Thi离开了电极表面。图4.5传感器制备过程的CV表征：A中为GCE(a)、depAu/GCE(b)、SA/depAu/GCE(c)分别3-/4-在[Fe(CN)6]溶液的CV响应曲线，B图为S1-pPtNPs-P1/SA/depAu/GCE（d）、HCR嵌入硫堇后的电极（e）、孵育目标物之后的修饰电极（f）PBS中的CV响应曲线3-/4-Fig.4.5(A)CVsin[Fe(CN)6]ofbareGCE(a),depAu/GCE(b),SA/depAu/GCE(c).(B)CVsinPBSofS1-pPtNPs-P1/SA/depAu/GCE(d),theresultingelectrodetreatedwiththemixtureofS1,S2andThi(e)andfollowedbyMMP-2(f).4.2.3HCR的凝胶电泳表征运用凝胶电泳证实HCR的顺利进行，分别测试单独的S1、S2、S1和S2同时存在时在聚丙烯酰胺凝胶的电泳现象。其中，HCR反应的时间为60min。如图4.6所示，当单独存在S1或者S2时只出现一条吸收带（带1和带2）。当S1和S2同时存在时，引发HCR能够形成双链DNA复合物。图4.6中观察到与具有高分子质量的物质的吸收带相似的吸收带（带3），并且与带1和带2存在明显区别，表明S1和S2成功的形成了双链DNA复合物。4.3.4实验条件的优化为了提高所制备传感器的分析性能，对实验条件进行优化，包括MMP-2孵育时间，测试底液中H2O2的浓度和测试底液的pH。图4.7A显示了传感器孵育100-1-1pg∙mLMMP-2不同时间条件下，在1mL0.1mol∙LPBS（pH7.0）中的DPV响应曲线，孵育时间分别为0、20、40、60、80、100、120、140min。电化学信号随着孵育时间的增加而显著降低，并在120min时达到一个平台，表明MMP-2对多肽的剪切已经达到最佳效果。因此，MMP-2的最佳孵育时间为2h。36 第四章基于目标物诱导多肽剪切的信号‘on-off’型的多肽传感器用于基质金属蛋白酶-2检测此外，测试底液中H2O2的含量会影响传感器的电催化效率和灵敏度。图4.7B为制备的传感器在含有不同体积H2O2的PBS（pH7.0）中的DPV响应。加入H2O2的体积依次为0、20、40、60、80、100μL，随着H2O2体积的增加，DPV峰电流-1逐渐增大，并在80μL时达到最大值（相当于2.22mmol∙L）。因此，测试底液中-1H2O2的最佳浓度为2.22mmol∙L。传感器在不同pH的PBS中的DPV响应曲线如图4.7C所示。测试底液为1mL-10.1mol∙LPBS，pH分别为5.0、6.0、7.0、7.5和8.0。从图中可以看出，当溶液的pH为7.0时，电化学响应信号最高。因此，测试底液的最佳pH为7.0。-1-1图4.6杂交链式反应的凝胶电泳表征：带1为2.5μmol∙LS1，带2为2.5μmol∙LS2，带3为二者的混合物（HCR反应时间为60min）-1-1Fig.4.6Polyacrylamidegelelectrophoresischaracterization:2.5μmol∙LS1(lane1),2.5μmol∙LS2(lane2),theirmixture(lane3)(HCRtimewas60min).图4.7实验条件的优化：MMP-2剪切时间（A），测试底液中H2O2浓度的优化（B），测试底液pH的优化（C），插图为在不同PBS中的DPV信号Fig.4.7Effectofdifferentdetectionconditionsontheelectrochemicalperformanceofproposedbiosensor:MMP-2incubationtime(A),H2O2concentration(B)andpHoftestingbuffer(C).TheinsertsareDPVsignalsobtainedindifferentPBS.4.3.5不同纳米探针信号放大效果的对比为了证明本实验所用的纳米探针具有最优的性能，将S1-pPtNPs-P1纳米探针与其它两种纳米探针进行对比，分别为Thi-pPtNPs-P1和S1-PtNPs-P1。DPV响应-1曲线是在1mL含有2.22mmol∙LH2O2的PBS（pH7.0）中孵育MMP-2前后分别37 西南大学硕士学位论文测定。如图4.8A所示，当使用Thi-pPtNPs-P1纳米探针时，DPV峰电流在信号‘on’（I0）和‘off’（I）状态下都相对最小，峰电流差值也只有6.35μA。这是由于该纳米探针中缺少S1，S1和S2之间的HCR不能被引发。在图4.8B中得到了较大的I0和I，电流响应差值达到了10.42μA，表明使用S1-PtNPs-P1纳米探针时，由于S1的存在能够引发HCR从而带来较大的电流差值。然而，当引入目标探针S1-pPtNPs-P1时，I0和I达到最大，并且得到了最大的电流变化值21.08μA（图4.8C）。所设计的纳米探针性能最为优越缘于以下原因：由于S1-pPtNPs-P1中S1的存在，S1和S2之间的HCR能够被引发，从而形成带有负电骨架的双链DNA，通过静电吸附作用能够嵌入大量的电活性物质Thi；与无孔的PtNPs相比，具有更大比表面积和催化活性的pPtNPs能够固载更多的S1，从而引入更多的电活性物质Thi。实验结果证明，由于HCR和pPtNPs的使用，使得传感器的响应信号和灵敏度得到显著提高。图4.8孵育不同纳米探针传感器的DPV响应：Thi-pPtNPs-P1(A),S1-PtNPs-P1(B),S1-pPtNPs-P1(C)；蓝色曲线和红色曲线分别代表孵育目标物之前（I0）和孵育目标物之后（I）的DPV响应曲线Fig.4.8DPVresponsesofthebiosensorspreparedbyusingdifferentnanoprobes:Thi-pPtNPs-P1(A),S1-PtNPs-P1(B),S1-pPtNPs-P1(C)inPBSbefore(blueline,I0)andafter(redline,I)4.3.6多肽传感器的校准曲线最优实验条件下，将制备的传感器孵育不同浓度的MMP-2，并在含有2.22-1-1mmol∙LH2O2的PBS（0.1mol∙L，pH7.0）中进行DPV测定。如图4.9A所示，-1随着MMP-2的浓度由0增加到10ng∙mL，DPV响应信号（I）逐渐降低。从图-1-14.9B所示的结果可得，在1pg∙mL到10ng∙mL范围内，DPV电流差值Δ（IΔI=I-I0）与MMP-2浓度的对数值成比例。线性方程为ΔI=8.048lgc+4.866，线性相关系数-1为0.995。计算出该传感器的检测下限为0.32pg∙mL。如表4.1所示，与已报道的检测MMP-2的其它方法相比（如荧光、光致发光等），本实验所构建的信号‘on-off’型电化学多肽传感器具有最宽的检测范围和最低的检测下限。38 第四章基于目标物诱导多肽剪切的信号‘on-off’型的多肽传感器用于基质金属蛋白酶-2检测图4.9（A）多肽传感器孵育不同浓度MMP-2的DPV响应，（B）传感器的线性校准曲线Fig.4.9(A)DPVresponsesoftheproposedbiosensorfordifferentconcentrationsofMMP-2,(B)TheresultantlinearcalibrationcurveforMMP-2concentration.表4.1不同方法检测MMP-2的传感器性能对比Table4.1TheperformancecomparisonofMMP-2biosensorsbasedondifferentmethodologiesaAnalyticalmethodsLinearrangeDetectionlimitReferences-1Photoluminescence-72ng∙mL94-1-1Fluorescence14.4-144ng∙mL3.61ng∙mL95-1-1SPR0-7.2ng∙mL36pg∙mL96-1-1FRET0.076-0.76μg∙mL12.5ng∙mL97-1Bioluminescent50-1000ng∙mL-98-1BRET-2ng∙mL99-1-1DPV0.1-1μg∙mL0.1μg∙mL100-1-1DPV1-10000pg∙mL0.32pg∙mLOurworkaFRET:fluorescenceresonanceenergytransfer,BRET:bioluminescentresonanceenergytransfer.4.3.7多肽传感器用于检测MMP-2的选择性、稳定性及重现性研究传感器的选择性是通过将其它可能存在的干扰物质孵育到电极表面与目标物-1MMP-2的电流信号进行对比来探究的。DPV响应曲线在1mL含有2.22mmol∙L-1-1H2O2的PBS（0.1mol∙L，pH7.0）中进行测定。目标物MMP-2的浓度为0.1ng∙mL，-1干扰物质MgCl2、KCl、IgG、glucose、L-cys和BSA的浓度均为10mg∙mL，TB的-1浓度为10ng∙mL。图4.10分别展示了孵育MMP-2和其它干扰物前后的DPV响应差值ΔI。显然，通过三次的平行测定，尽管干扰物质的浓度为目标物浓度的上百倍，所测得的ΔI值与空白溶液相差不大。只有孵育目标物MMP-2时才能得到较显著的电流差值，表明该传感器具有良好的选择性。-1-1在传感器孵育过0.1ng∙mLMMP-2后，将其放入1mL0.1mol∙LPBS-1（pH=7.0）中，于–0.5V~0.1V电位范围内、扫速为100mV∙s的条件下进行连续39 西南大学硕士学位论文CV扫描50圈，结果如图4.11所示。传感器在50圈CV扫描后的峰电流只减小了-16.98%，表明此传感器具有良好的稳定性。另外，将6根电极同时孵育0.1ng∙mL-1MMP-2，并在相同条件下进行DPV测定，测试底液为1mL含有2.22mmol∙LH2O2-1的PBS（0.1mol∙L,pH=7.0）。所测得的电流相对标准偏差（RSD）为6.3%，表明该传感器具有良好的重现性。-1图4.10制备的三批多肽传感器的选择性，MMP-2的浓度为0.1ng∙mL，干扰物质TB的浓度-1-1为10ng∙mL，MgCl2、KCl、IgG、glucose、L-cys和BSA的浓度均为10mg∙mLFig.4.10TheDPVresponsesofthreebatchesoftheproposedbiosensorforMMP-2againstTB(10-1ng∙mL)andMgCl2,KCl,IgG,glucose,L-cysandBSA.-1图4.11制备的多肽传感器孵育100pg∙mLMMP-2时的稳定性-1Fig.4.11Thestabilityoftheproposedbiosensorfor100pg∙mLMMP-2.4.3.8多肽传感器分析应用传感器的实际应用是通过检测实际血清样品中标准法加入的MMP-2的值进行分析。将不同浓度的MMP-2分别加入到稀释10倍的血清样品中，血清样品取自重庆新桥医院。将配制好的样品应用于多肽传感器中，并进行DPV测定，测试底-1-1液为1mL含有2.22mmol∙LH2O2的PBS（0.1mol∙L，pH7.0），扫描范围为−0.5到0.1V。如表4.2所示，通过3次平行测定，所得的回收率和相对标准偏差（RSD）40 第四章基于目标物诱导多肽剪切的信号‘on-off’型的多肽传感器用于基质金属蛋白酶-2检测分别为92.3%-107%和3.5%-6.9%。证明所构建的电化学传感平台有希望应用于MMP-2的实际检测。表4.2制备的传感器用于血清样品中检测MMP-2的加标回收率Table4.2DetectionofMMP-2addedinhumanbloodserumwiththeproposedbiosensorSamplesAddedMMP-2FoundMMP-2Recovery/(%)RSD/(%)-1-1110.0pg∙mL10.3pg∙mL1034.8-1-1250.0pg∙mL46.7pg∙mL93.46.9-1-130.10ng∙mL0.92ng∙mL92.03.5-1-140.50ng∙mL0.53ng∙mL1075.8-1-151.00ng∙mL1.06ng∙mL1064.24.4结论基于目标物诱导多肽剪切，本文成功构建了信号‘on-off’型的电化学多肽传感器用于MMP-2的检测。所修饰的电极的DPV响应会随着目标物MMP-2孵育的存在而变化。孵育目标物之前信号较大为‘on’状态，孵育目标物之后信号明显降低为‘off’状态。将与多肽剪切相关联信号直接转换为可直接测量的电化学信号，提供了简单、方便、灵敏的检测MMP-2的方法。与其他方法相比，本实验通过HCR和pPtNPs催化放大的联合使用，所构建信号‘on-off’型检测MMP-2的传感平台，具有高的灵敏度、令人满意的选择性和稳定性。此外，通过简单的基质多肽探针的替换，所构建的传感平台有望应用于检测MMP-2和其它MMPs或蛋白酶。41 参考文献参考文献[1]ClarkL.C.,LyonsC.,Electrodesystemsforcontinuousmonitoringincardiovascularsurgery.AnnalsoftheNewYorkAcademyofsciences1962,102,29-45.[2]RogersK.R.,Recentadvancesinbiosensortechniquesforenvironmentalmonitoring.AnalyticalChimicaActa2006,568,222-231.[3]Rodriguez-MozazS.,MarcoM.P,LopezdeAldaM.J.,BarcelóD.,Biosensorsforenvironmentalmonitoringofendocrinedisruptors:areviewarticle,Analyticalandbioanalyticalchemistry2004,378,588-598.[4]ZhaoJ.,LinF.B.,YiY.H.,HuangY.,LiH.T.,ZhangY.Y.,YaoS.Z.,Dualamplificationstrategyofhighlysensitivethrombinamperometricaptasensorbasedonchitosan-Aunanocomposites.Analyst2012,137,3488-3495.[5]HuangY.,ChenJ.,ZhaoS.L.,ShiM.,ChenZ.F.,LiangH.,Label-freecolorimetricaptasensorbasedonnickingenzymeassistedsignalamplificationandDNAzymeamplificationforhighlysensitivedetectionofprotein.AnalyticalChemistry2013,85,4423-4430.[6]VermeirS.,NicolaïB.M.,VerbovenP.,VanGerwenP.,BaetenB.,HoflackL.,VulstekeV.,LammertyJ.,Microplatedifferentialcalorimetricbiosensorforascorbicacidanalysisinfoodandpharmaceuticals.AnalyticalChemistry2007,79,6119-6127.[7]GuoX.,LinC.S.,ChenS.H.,YeR.,WuV-C.H.,Apiezoelectricimmunosensorforspecificcaptureandenrichmentofviablepathogensbyquartzcrystalmicrobalancesensor,followedbydetectionwithantibody-functionalizedgoldnanoparticles.BiosensorsandBioelectronics2012,38,177-183.[8]JeseungO.,GuY.,YoungWookC.,HyungJoonK.,JoachimJ.,EosuK.,Jae-ChulP.,Kyung-HwaY.,Acarbonnanotubemetalsemiconductorfieldeffecttransistor-basedbiosensorfordetectionofamyloid-betainhumanserum.BiosensorsandBioelectronics2013,50,345-350.[9]ZhongH.A.,YuanR.,ChaiY.Q.,LiW.J.,ZhongX.,ZhangY.,Insituchemo-synthesizedmulti-wallcarbonnanotube-conductivepolyanilinenanocomposites:Characterizationandapplicationforaglucoseamperometricbiosensor.Talanta2011,85,104-111.[10]FengL.,ChenY.,RenJ,QuX.,Agraphenefunctionalizedelectrochemicalaptasensorforselectivelabel-freedetectionofcancercells.Biomaterials2011,32,2930-2937.43 西南大学硕士学位论文[11]ZhaoN..,HeY.Q.,MaoX.,SunY.H.,ZhangX.B.,LiC.Z.,LinY.H.,LiuG.D.,Electrochemicalassayofactiveprostate-specificantigen(PSA)usingferrocene-functionalizedpeptideprobes.ElectrochemistryCommunications2010,12,471-474.[12]MulchandaniA.,MulchandaniP.,KanevaI.,ChenW.,Biosensorfordirectdeterminationoforganophosphatenerveagentsusingrecombinantescherichiacoliwithsurface-expressedorganophosphorushydrolase.1.potentiometricmicrobialelectrode.AnalyticalChemistry1998,70,4140-4145.[13]LinY.X.,ZhouQ.,LinY.P.,TangD.Y.,ChenG.N.,TangD.P.,SimpleandsensitivedetectionofaflatoxinB1withinfiveminuteusinganon-conventionalcompetitiveimmunosensingmode.BiosensorsandBioelectronics2015,74,680-686.[14]HuangH.Y.,BaiW.Q.,DongC.X.,GuoR.,LiuZ.H.,AnultrasensitiveelectrochemicalDNAbiosensorbasedongrapheneAunanorod/polythionineforhumanpapillomavirusDNAdetection.BiosensorsandBioelectronics2015,68,442-446.[15]SchmidtA.C.,WangX.,ZhuY.T.,SombersL.A.,Carbonnanotubeyarnelectrodesforenhanceddetectionofneurotransmitterdynamicsinlivebraintissue.ACSNano2013,7,7864-7873.[16]马丽，白燕，刘仲明．传感器技术2002,21,58．[17]LiJ.,ZhangC.,CansizS.,WuC.C.,XuJ.H.,CuiC.,LiuY.,HouW.J.,WangY.Y.,ZhangL.Q.,TengI.,YangH.H.,TanW.H.,Self-assemblyofDNAnanohydrogelswithcontrollablesizeandstimuli-responsivepropertyfortargetedgeneregulationtherapy.JournaloftheAmericanChemicalSociety2015,137,1412-1415.[18]HuangY.E.,ChangH.T.,TanW.H.,Cancercelltargetingusingmultipleaptamersconjugatedandnanorods.AnalyticalChemistry2008,80,567-572.[19]JiangY.X.,ZhuC.E.,LingL.S.,WanL.J.,FangX.H.,BaiC.,Specificaptamer-proteininteractionstudiedbyatomicforcemicroscopy.AnalyticalChemistry2003,75,2112-2116.[20]谢海燕，陈薛钗，邓玉林，核酸适配体及其在化学领域的相关应用．化学进展2007,19,1026-1033.[21]JiangL.P.,YuanR.,ChaiY.Q.,YuanY.L.,BaiL.J.,WangY.,Aptamer-basedhighlysensitiveelectrochemicaldetectionofthrombinviatheamplificationofgraphene.Analyst2012,137,2415-2420.44 参考文献[22]ChenJ.,ZhangJ.,LiJ.,YangHH.,FuF.,ChenG.,Anultrasensitivesignal-onelectrochemicalaptasensorviatarget·inducedconjunctionofsplitaptamerfragments.BiosensorsandBioelectronics2010,25,996-1000.[23]GaoF.L.,QianY.,ZhangL.,DaiS.Z.,LanY.F.,ZhangY.,DuL.L.,TangD.Q.,Targetcatalyzedhairpinassemblyforconstructingaratiometricelectrochemicalaptasensor.BiosensorsandBioelectronics2015,71,158-163.[24]QianY.,GaoF.L.,DuL.L.,ZhangY.,TangD.Q.,YangD.Z.,Anovellabel-freeandenzyme-freeelectrochemicalaptasensorbasedonDNAinsitumetallization.BiosensorsandBioelectronics2015,74,483-490.[25]ZhangX.,QiB.,LiY.,ZhangS.,Amplifiedelectrochemicalaptasensorforthrombinbasedonbio-barcodemethod.BiosensorsandBioelectronics2009,25,259-262.[26]ChenY.,JiangB.,XiangY.,ChaiY.Q.,YuanR.,Targetrecyclingamplificationforsensitiveandlabel-freeimpedimetricgenosensingbasedonhairpinDNAandgraphene/Aunanocomposites.ChemicalCommunications2011,47,12798-12800．[27]XuL.P.,WangS.Q.,DongH.F.,LiuG.D.,WenY.Q.,WangS.T.,ZhangX.J.,Fractalgoldmodifiedelectrodeforultrasensitivethrombindetection.Nanoscale2012,4,3786-3790.[28]SunX.,LiF.L.,ShenG.H.,HuangJ.D.,WangX.Y.,Aptasensorbasedonthesynergisticcontributionsofchitosan-goldnanoparticles,graphene-goldnanoparticlesandmulti-walledcarbonnanotubes-cobaltphthalocyaninenanocompositesforkanamycindetection.Analyst2014,139,299-308.[29]WangY.G.,ZhangY.,YanT.,FanD.W.,DuB.,MaH.M.,WeiQ.,UltrasensitiveelectrochemicalaptasensorforthedetectionofthrombinbasedondualsignalamplificationstrategyofAu@GSandDNA-CoPdNPsconjugates.BiosensorsandBioelectronics2016,80,640-646.[30]SkerraA.,Alternativenon-antibodyscaffoldsformolecularrecognition.CurrentOpinionBiotechnolical2007,18,295-304.[31]McQuistanA.,ZaitounaA.J.,EcheverriaE.,LaiR.Y.,Useofthiolatedoligonucleotidesasanti-foulingdiluentsinelectrochemicalpeptide-basedsensors.ChemicalCommunications2014,50,4690-4692.[32]JohnsonS.,EvansD.,LaurensonS.,PaulD.,DaviesA.G.,FerrignoP.K.,Wa1ltiC.,Surface-immobilizedpeptideaptamersasprobemoleculesforproteindetection.Analytical45 西南大学硕士学位论文Chemistry2008,80,978-983.[33]ButterfieldS.M.,WatersM.L.,Adesignedβ-hairpinpeptideformolecularrecognitionofATPinwater.JournaloftheAmericanChemicalSociety2003,125,9580-9581.[34]GerasimovJ.Y.,LaiR.Y.,Anelectrochemicalpeptide-basedbiosensingplatformforHIVdetection.ChemicalCommunications2010,46,395-397.[35]XuH.F.,YeH.Z.,YuL.S.,ChiY.W.,LiuX.X.,ChenG.N.,Tailor-madepeptidesensorfordetectionofmatrixmetalloproteinase2inbloodserum.AnalyticalMethods2015,7,5371-5374.[36]XuB.Y.,ZhengD.L.,QiuW.W.,GaoF.,JiangS.X.,WangQ.X.,AnultrasensitiveDNAbiosensorbasedoncovalentimmobilizationofprobeDNAonfernleaf-likeα-Fe2O3andchitosanHybridfilmusingterephthalaldehydeasarm-linker.BiosensorsandBioelectronics2015,72,175-181.[37]HeZ.Y.,ZangS.,LiuY.J.,HeY.,LeiH.T.,Amulti-walledcarbonnanotubes-poly(L-lysine)modifiedenantioselectiveimmunosensorforofloxacinbyusingmulti-enzyme-labeledgoldnanoflowerassignalenhancer.BiosensorsandBioelectronics2015,73,85-92.[38]ZhangJ.,ChaiY.Q.,Yuan.R.,YuanY.L.,BaiL.J.,XieS.B.,Ahighlysensitiveelectrochemicalaptasensorforthrombindetectionusingfunctionalizedmesoporoussilica@multiwalledcarbonnanotubesassignaltagsandDNAzymesignalamplification.Analyst2013,138,6938-6945.[39]GaoJ.,DuB.,ZhangX.Y.,GuoA.P.,ZhangY.,WuD.,MaH.M.,WeiQ.,Ultrasensitiveenzyme-freeimmunoassayforsquamouscellcarcinomaantigenusingcarbonsupportedPd-Auaselectrocatalyticlabels.AnalyticaChimicaActa2014,833,9-14.[40]BaghayeriM.,VeisiH.,FabricationofafacileelectrochemicalbiosensorforhydrogenperoxideusingefficientcatalysisofhemoglobinontheporousPd@Fe3O4-MWCNTnanocomposite.BiosensorsandBioelectronics2015,74,190-198.[41]ZhouQ.,LinY.X.,LinY.P.,WeiQ.H.,ChenG.N.,TangD.P.,HighlysensitiveelectrochemicalsensingplatformforleadionbasedonsynergeticcatalysisofDNAzymeandAu-Pdporousbimetallicnanostructures.BiosensorsandBioelectronics2016,78,236-248.[42]ZhangB.,HeY.,LiuB.Q.,TangD.P.,NiCoBP-dopedcarbonnanotubehybrid:Anoveloxidasemimeticsystemforhighlyefficientelectrochemicalimmunoassay.AnalyticaChimicaActa2014,851,49-56.46 参考文献[43]FengT.T.,QiaoX.W.,WangH.N.,SunZ.,HongC.L.,Asandwich-typeelectrochemicalimmunosensorforcarcinoembryonicantigenbasedonsignalamplificationstrategyofoptimizedferrocenefunctionalizedFe3O4@SiO2aslabels.BiosensorsandBioelectronics2016,79,48-56.[44]ShuH.W.,WenW.,XiongH.Y.,ZhangX.H.,WangS.F.,Novelelectrochemicalaptamerbiosensorbasedongoldnanoparticlessignalamplificationforthedetectionofcarcinoembryonicantigen.ElectrochemistryCommunications2013,37,15-19.[45]SunD.P.,LuJ.,ZhongY.W.,YuY.Y.,WangY.,ZhangB.B.,ChenZ.G.,Sensitiveelectrochemicalaptamercytosensorforhighlyspecificdetectionofcancercellsbasedonthehybridnanoelectrocatalystsandenzymeforsignalamplification.BiosensorsandBioelectronics2016,75,301-307.[46]LiangR.P.,TianX.C.,QiuP.,QiuJ.D.,Multiplexedelectrochemicaldetectionoftrypsinandchymotrypsinbasedondistinguishablesignalnanoprobes.AnalyticalChemistry2014,86,9256-9263.[47]BaiL.J.,YuanR.,ChaiY.Q.,YuanY.L.,WangY.,XieS.B.,Directelectrochemistryandelectrocatalysisofaglucoseoxidase-functionalizedbioconjugateasatracelabelforultrasensitivedetectionofthrombin.ChemicalCommunications2012,48,10972-10974.[48]JiangB.Y.,WangM.,LiC.,XieJ.P.,Label-freeandamplifiedaptasensorforthrombindetectionbasedonbackgroundreductionanddirectelectrontransferofhemin.BiosensorsandBioelectronics2013,43,289-292.[49]YiH.Y.,XuW.J.,YuanY.L.,BaiL.J.,WuY.M.,ChaiY.Q.,YuanR.,Apseudotriple-enzymecascadeamplifiedaptasensorforthrombindetectionbasedonhemin/G-quadruplexassignallabel.BiosensorsandBioelectronics2014,54,415-420.[50]QianY.,GaoF.L.,DuL.L.,ZhangY.,TangD.Q.,YangD.Z.,Anovellabel-freeandenzyme-freeelectrochemicalaptasensorbasedonDNAinsitumetallization.BiosensorsandBioelectronics2015,74,483-490.[51]WangY.Y.,LiuB.,Conjugatedpolyelectrolyte-sensitizedfluorescentdetectionofthrombininbloodserumusingaptamer-immobilizedsilicananoparticlesastheplatform.Langmuir2009,25,12787-12793.[52]YanS.Y.,HuangR.,ZhouY.Y.,ZhangM.,DengM.G.,WangX.L.,WengX.C.,ZhouX.,Aptamer-basedturn-onfluorescentfour-branchedquaternaryammoniumpyrazineprobeforselectivethrombindetection.ChemicalCommunications2011,47,1273-1275.47 西南大学硕士学位论文[53]CoussensL.M.,FingletonB.,MatrisianL.M.,Matrixmetalloproteinaseinhibitorsandcancer:trialsandtribulations.Science2002,295,2387-2392.[54]MatsumuraS.,AokiI.,SagaT.,ShibaK.,Atumor-environment-responsivenanocarrierthatevolvesitssurfacepropertiesuponsensingmatrixmetalloproteinase-2andinitiatesagglomerationtoenhanceT2relaxivityformagneticresonanceimaging.Mol.Pharmaceutics2011,8,1970-1974.[55]ZhangY.W.,SunX.P.,Anovelfluorescentaptasensorforthrombindetection:usingpoly(m-phenylenediamine)rodsasaneffectivesensingplatform.ChemicalCommunications2011,47,3927-3929.[56]LiXM.,SunL.,GeA.Q.,GuoY.S.,Enhancedchemiluminescencedetectionofthrombinbasedonceriumoxidenanoparticles.ChemicalCommunications2011,47,947-949.[57]WangL.,ZhuC.Z.,HanL.,JinL.H.,ZhouM.,DongS.J.,Label-free,regenerativeandsensitivesurfaceplasmonresonanceandelectrochemicalaptasensorsbasedongraphene.ChemicalCommunications2011,47,7794-7796.[58]HuangY.,ChenJ.,ZhaoS.L.,ShiM.,ChenZ.F.,LiangH.,Label-freecolorimetricaptasensorbasedonnickingenzymeassistedsignalamplificationandDNAzymeamplificationforhighlysensitivedetectionofprotein.AnalyticalChemistry2013,85,4423-4430.[59]BiniA.,MinunniM.,TombelliS.,CentiS.,MasciniM.,Analyticalperformancesofaptamer-basedsensingforthrombindetection.AnalyticalChemistry2007,79,3016-3019.[60]ZhaoJ.,LinF.B.,YiY.H.,HuangY.,LiH.T.,ZhangY.Y.,YaoS.Z.,Dualamplificationstrategyofhighlysensitivethrombinamperometricaptasensorbasedonchitosan-Aunanocomposites.Analyst2012,137,3488-3495.[62]WangH.T.,LuZ.Y.,KongD.S.,SunJ.,HymelT.M.,CuiY.,ElectrochemicaltuningofMoS2forefficienthydrogenevolution.ACSNano2014,8,4940-4947.[63]HuangK.J.,LiuY.J.,WangH.B.,WangY.Y.,LiuY.M.,Sub-femtomolarDNAdetectionbasedonlayeredmolybdenumdisulfide/multi-walledcarbonnanotubecomposites,Aunanoparticleandenzymemultiplesignalamplification.BiosensorsandBioelectronics2014,55,195-202.[64]FengQ.L.,DuanK.Y.,YeX.L.,LuD.B.,DuY.L.,WangC.M.,Anovelwayfordetectionofeugenolviapoly(diallyldimethylammoniumchloride)functionalizedgraphene-MoS248 参考文献nano-flowerfabricatedelectrochemicalsensor.SensorsandActuatorsB:Chemical2014,192,1-8.[65]HuangY.,ChenJ.,ZhaoS.L.,ShiM.,ChenZ.F.,LiangH.,Label-freecolorimetricaptasensorbasedonnickingenzymeassistedsignalamplificationandDNAzymeamplificationforhighlysensitivedetectionofprotein.AnalyticalChemistry2013,85,4423-4430.[66]ZhangY.W.,SunX.P.,Anovelfluorescentaptasensorforthrombindetection:usingpoly(m-phenylenediamine)rodsasaneffectivesensingplatform.ChemicalCommunications2011,47,3927-3929.[67]LiL.D.,ZhaoH.T.,ChenZ.B.,MuX.J.,GuoL.,Aptamerbiosensorforlabel-freeimpedancespectroscopydetectionofthrombinbasedongoldnanoparticles.SensorsandActuatorsB:Chemical2011,157,189-194.[68]BaiY.F.,FengF.,ZhaoL.,WangC.Y.,WangH.Y.,TianM.Z.,QinJ.,DuanY.L.,HeX.X.,Aptamer/thrombin/aptamer-AuNPssandwichenhancedsurfaceplasmonresonancesensorforthedetectionofsubnanomolarthrombin.BiosensorsandBioelectronics2013,47,265-270.[69]BaiL.J.,YuanR.,ChaiY.Q.,YuanYL.,MaoL.,ZhuoY.,Highlysensitiveelectrochemicallabel-freeaptasensorbasedondualelectrocatalyticamplificationofPt-AuNPsandHRP.Analyst2011,136,1840-1845.[70]KangY.,FengK.J.,ChenJ.W.,JiangJ.H.,ShenG.L.,YuR.Q.,Electrochemicaldetectionofthrombinbysandwichapproachusingantibodyandaptamer.Bioelectrochemistry2008,73,76-81.[71]FanH.,LiH.,WangQ.J.,HeP.G.,FangY.Z.,Ahost-guest-recognition-basedelectrochemicalaptasensorforthrombindetection.BiosensorsandBioelectronics2012,35,33-36.[72]JinG.X.,LuL.J.,GaoX.Y.,LiM.J.,QiuB.,LinZ.Y.,YangH.H.,ChenG.N.,Magneticgrapheneoxide-basedelectrochemiluminescentaptasensorforthrombin.ElectrochimicaActa2013,89,13-17.[73]BaoJ.,ChenW.,LiuT.T.,ZhuY.L.,JinP.Y.,WangL.Y.,LiuJ.F.,WeiY.G.,LiY.D.,BifunctionalAu-Fe3O4nanoparticlesforproteinseparation.ACSNano2007,1,293-298.[74]HeX.L.,TanL.F.,ChenD.,WuX.L.,RenX.L.,ZhangY.Q.,MengX.W.,TangF.Q.,Fe3O4-Au@mesoporousSiO2microspheres:anidealartificialenzymaticcascadesystem.49 西南大学硕士学位论文ChemicalCommunications2013,49,4643-4645.[75]KanekoN.,HoriiK.,KatoS.,AkitomiJ.,WagaI.,High-throughputquantitativescreeningofperoxidase-mimickingDNAzymesonamicroarraybyusingelectrochemicaldetection.AnalyticalChemistry2013,85,5430-5435.[76]CaoH.M.,SunX.M.,ZhangY.,HuC.Y.,JiaN.Q.,Electrochemicalsensingbasedonhemin-orderedmesoporouscarbonnanocompositesforhydrogenperoxide.AnalyticalMethods2012,4,2412-2416.[77]FuY.C.,WangT.,BuL.J.,XieQ.J.,LiP.H.,ChenJ.H.,YaoS.Z.,Apost-labelingstrategybasedondye-inducedpeelingoftheaptameroffsingle-walledcarbonnanotubesforelectrochemicalaptasensing.ChemicalCommunications2011,47,2637-2639.[78]LiB.L.,WangY.L.,WeiH.,DongS.J.,AmplifiedelectrochemicalaptasensortakingAuNPsbasedsandwichsensingplatformasamodel.BiosensorsandBioelectronics2008,23,965-970.[79]ZhengA.X.,WangJ.R.,LiJ.,SongX.R.,ChenG.N.,YangH.H.,Enzyme-freefluorescenceaptasensorforamplificationdetectionofhumanthrombinviatarget-catalyzedhairpinassembly.BiosensorsandBioelectronics2012,36,217-221.[80]ChenQ.,TangW.,WangD.Z.,WuX.J.,LiN.,LiuF.,AmplifiedQCM-Dbiosensorforproteinbasedonaptamer-functionalizedgoldnanoparticles.BiosensorsandBioelectronics2010,26,575-579.[81]LiF.,CuiH.,Alabel-freeelectrochemiluminescenceaptasensorforthrombinbasedonnovelassemblystrategyofoligonucleotideandluminolfunctionalizedgoldnanoparticles.BiosensorsandBioelectronics2013,39,261-267.[82]ZhangZ.X.,WangZ.J.,WangX.L.,YangX.R.,Magneticnanoparticle-linkedcolorimetricaptasensorforthedetectionofthrombin.SensorsandActuatorsB:Chemical2010,147,428-433.[83]PatelS.,SumitraG.,KonerB.C.,SaxenaA.,Roleofserummatrixmetalloproteinase-2and-9topredictbreastcancerprogression.ClinicalBiochemistry2011,44,869-872.[84]EissaS.,Ali-LabibR.,SwellamM.,BassionyM.,TashF.,El-ZayatT.M.,Noninvasivediagnosisofbladdercancerbydetectionofmatrixmetalloproteinases(MMP-2andMMP-9)andtheirinhibitor(TIMP-2)inurine.EuropeanUrology2007,52,1388-1397.[85]WangY.H.,ShenP.,LiC.Y.,WangY.Y.,LiuZ.H.,Upconversionfluorescenceresonance50 参考文献energytransferBasedbiosensorforultrasensitivedetectionofmatrixmetalloproteinase-2inblood.AnalyticalChemistry2012,84,1466-1473.[86]ZhengT.T.,ZhangR.,ZhangQ.F.,TanT.T.,ZhangK.,ZhuJ.J.,WangH.,Ultrasensitivedual-channeldetectionofmatrixmetalloproteinase-2inhumanserumusinggold-quantumdotcore-satellitenanoprobes.ChemicalCommunications2013,49,7881-7883.[87]HuR.,FuT.,ZhangX.B.,KongR.M.,QiuL.P.,LiuY.R.,LiangX.T.,TanW.H.,ShenG.L.,YuR.Q.,Aproximity-dependentsurfacehybridizationstrategyforconstructinganefficientsignal-onelectrochemicalDNAzymesensingsystem.ChemicalCommunications2012,48,9507-9509.[88]KuangH.,ChenW.,XuD.H.,XuL.G.,ZhuY.Y.,LiuL.Q.,ChuH.Q.,PengC.F.,XuC.L.,ZhuSF.,Fabricatedaptamer-basedelectrochemical“signal-off”sensorofochratoxinA.BiosensorsandBioelectronics2010,26,710-716.89Prieto-SimnB.,SamitierJ.,“Signaloff”aptasensorbasedonenzymeinhibitioninducedbyconformationalswitch.AnalyticalChemistry2014,86,1437-1444.90ZhangP.,WuX.Y.,YuanR.,ChaiY.Q.,An“off-on”electrochemiluminescentbiosensorbasedonDNAzyme-assistedtargetrecyclingandrollingcircleamplificationsforultrasensitivedetectionofmicroRNA.AnalyticalChemistry2015,87,3202-3207.[91]YouT.Y.,NiwaO.,TomitaM.,HironoS.,Characterizationofplatinumnanoparticle-embeddedcarbonfilmelectrodeanditsdetectionofhydrogenperoxide.AnalyticalChemistry2003,75,2080-2085.[92]ZhaoJ.J.,ChenC.F.,ZhangL.L.,JiangJ.H.,YuR.Q.,Anelectrochemicalaptasensorbasedonhybridizationchainreactionwithenzyme-signalamplificationforinterferon-gammadetection.BiosensorsandBioelectronics2012,36,129-134.[93]WangS.Z.,KuaiL.,HuangY.C.,YuX.,LiuY.D.,LiW.Z.,ChenL.,GengB.Y.,Ahighlyefficient,clean-surface,porousplatinumelectrocatalystandtheinhibitioneffectofsurfactantsoncatalyticactivity.Chemistry:AEuropeanJournal2013,19,240-248.[94]LiJ.,LuC.H.,YaoQ.H.,ZhangX.L.,LiuJ.J.,YangH.H.,ChenG.N.,Agrapheneoxideplatformforenergytransfer-baseddetectionofproteaseactivity.BiosensorsandBioelectronics2011,26,3894-3899.[95]ChengW.,ChenY.L.,YanF.,DingL.,DingS.J.,JuH.X.,YinY.B.,Agrapheneoxide-peptidefluorescencesensortailor-madeforsimpleandsensitivedetectionofmatrix51 西南大学硕士学位论文metalloproteinase2.ChemicalCommunications2011,47,2877-2879.[96]Pieper-FürstU.,KleuserU.,StöckleinW.F-M.,WarsinkeA.,SchellerF.W.,Detectionofsubpicomolarconcentrationsofhumanmatrixmetalloproteinase-2byanopticalbiosensor.AnalyticalBiochemistry2004,332,160-167.[97]WangX.,XiaY.Q.,LiuY.Y.,QiW.X.,SunQ.Q.,ZhaoQ.,TangB.,Dual-luminophore-labeledgoldnanoparticleswithcompletelyresolvedemissionforthesimultaneousimagingofMMP-2andMMP-7inlivingcellsundersinglewavelengthexcitation.Chemistry:AEuropeanJournal2012,18,7189-7195.[98]KimY.P.,DanielW.L.,XiaZ.Y.,XieH.X.,MirkinC.A.,RaoJ.H.,Bioluminescentnanosensorsforproteasedetectionbasedupongoldnanoparticle-luciferaseconjugates.ChemicalCommunications2010,46,76-78.[99]YaoH.Q.,ZhangY.,XiaoF.,XiaZ.Y.,RaoJ.H.,Quantumdot/bioluminescenceresonanceenergytransferbasedhighlysensitivedetectionofproteases.AngewandteChemieInternationalEdition2007,46,4346-4349.[100]NingL.M.,MiaoP.,GaoT.,WangH.Y.,LiG.X.,Preparationandassemblyofcollagen-DNAcomplexonanelectrodesurfaceanditsapplicationtoproteinanalysis.ElectrochimicaActa2013,111,499-503.52 作者发表的部分相关论文题录作者发表的部分相关论文题录1.PeiJing,WenjuXu*,HuayuYi,YongmeiWu,LijuanBai,RuoYuan*,AnamplifiedelectrochemicalaptasensorforthrombindetectionbasedonpseudobienzymicFe3O4-Aunanocompositesandelectroactivehemin/G-quadruplexassignalenhancers.Analyst,2014,139,1756-1761.2.PeiJing,HuayuYi,ShuyanXue,YaqinChai,RuoYuan*,WenjuXu*,Asensitiveelectrochemicalaptasensorbasedonpalladiumnanoparticlesdecoratedgrapheme-molybdenumdisulfideflower-likenanocompositesandenzymaticsignalamplification.AnalyticaChimicaActa,2015,853,234-241.3.PeiJing,HuayuYi,ShuyanXue,RuoYuan,WenjuXu*,A‘signalon-off’electrochemicalpeptidebiosensorformatrixmetalloproteinase2basedontargetinducedcleavageofpeptide.RSCAdvances,2015,5,65725-65730.1,14.WenjuXu*,PeiJing,HuayuYi,ShuyanXue,RuoYuan,BimetallicPt/Pdencapsulatedmesoporous-hollowCeO2nanospheresforsignalamplificationtowardelectrochemicalpeptide-basedbiosensingformatrixmetalloproteinase2.SensorsandActuatorsB:Chemical,2016,230,345-352.5.WenjuXu*,ShuyanXue,HuayuYi,PeiJing,YaqinChai,RuoYuan*,Asensitiveelectrochemicalaptasensorbasedontheco-catalysisofhemin/G-quadruplex,platinumnanoparticlesandflower-likeMnO2nanospherefunctionalizedmulti-walledcarbonnanotubes.ChemicalCommunications,2015,51,1472-1474.1,16.WenjuXu*,HuayuYi,YaliYuan,PeiJing,YaqinChai,RuoYuan*,GeorgeS.Wilson,AnelectrochemicalaptasensorforthrombinusingsynergeticcatalysisofenzymeandporousAu@Pdcore-shellnanostructuresforsignalamplification.BiosensorsandBioelectronics,2015,64,423-428.7.许文菊，易华玉，张小丹，井佩，分析化学滴定实验学生常见问题分析及教学改进建议。西南师范大学学报（自然科学版），39卷，第3期，188-192。53 54 致谢致谢光阴荏苒，转眼间，在西南大学的研究生生活已经接近了尾声。回想起这三年里的点点滴滴，不禁感慨万千。美丽的西大校园留下了我许多美好的回忆，温暖的电化学分析实验室见证了我三年来的努力和成长。一路走来，收获颇丰！值此论文完成之际，谨向所有关心、帮助和支持过我的老师、同学、朋友及家人表示最诚挚的感谢和最美好的祝愿!首先，我要诚挚的感谢一直指导我前行的恩师许文菊老师。许老师严谨的科学精神、渊博的学识、不断追求和忘我的工作精神让我无比佩服，也将是我今后学习的榜样。无论是在我的科研还是在生活中，许老师都不遗余力的教导我和帮助我，教会了我很多，也让我成长了许多。感谢许老师这三年来的支持、帮助、鼓励与包容！即将踏上工作岗位的我，定会更加努力，不辜负恩师的期望。同时，我要感谢袁若、柴雅琴、卓颖、向云、杨霞、袁亚利等老师的关心与帮助。感谢袁若老师为我们创建的如此优越的科研平台，感谢柴雅琴老师在思想和生活上的无微不至的关怀，感谢各位老师在科研上的精心指导。在此，真心祝愿各位老师身体健康，幸福快乐！还要感谢冯晓辉、易华玉、杨哲涵、王海军等师兄师姐们的指导、关心与帮助。感谢许娟娟、张璞、叶萃等好朋友及薛舒燕、吕家佳、彭丽春、赵健敏、杨阳等师妹们的陪伴、关心、照顾与支持。美丽的西大校园留下了许多我们的欢声笑语，在你们的陪伴下，我的研究生生活无比丰富多彩，这些都将是我人生中最美好的回忆！最后，感谢我挚爱的家人们！在你们无私的关怀与付出下，我才能够安心顺利地完成学业。你们的爱护、关心与支持是我前进的动力与支撑。愿你们身体健康、一生平安幸福！井佩二零一六年四月于西南大学55