mstn纳米抗体的筛选和功能验证

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1、．■ｒ．Ｉ？＿．．。．气嘗：密级：Ｃ－分类号＇—位代码；１０７巧学号：２０１２１０８０１５单、；去，＼１＾３石河子大学：．、心．．＞－萃＿．．：苗、硕女營像讼矣令＊中。苗．．．．．．．＼’．．、戀ＭＳＴＮ纳米抗体的猜选和功能验证学位申请人李光简指导教师陈创夫教授盛金良副教授申请学位口类级别农学硕壬＇学科、专业葦称基础兽医学ａ研究方向动物疾病病理学所在学院动物科技学院中国？新疆？石河子

2、２０１５年６月分类号：密级：学号:2012108015单位代码：10759石河子大学硕士学位论文MSTN纳米抗体的筛选和功能验证学位申请人李尤简指导教师陈创夫教授盛金良副教授申请学位门类级别农学硕士学科、专业名称基础兽医学研究方向动物疾病病理学所在学院动物科技学院中国·新疆·石河子2015年6月PanningandidentificationofsheepmyostatinnanobodylibraryADissertationSubmittedtoShiheziUniversityInPartial

3、FulfillmentoftheRequirementsFortheDegreeofMasterofAgricultureByLiYoujian(BasicVeterinaryScience)DissertationSupervisor:Prof.ChenChuangfuShengJinliangJune,2015石河子大学学位论文独创性声明及使用授权声明学位论文独创性声明本人所呈交的学位论文是在我导师的指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其

4、他个人己经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中作了明确的说明并表示谢意。？；占：时间３曰研究生签《：Ｘ女年月使用授权声明本人完全了解石河子大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保留学位论文并向国家主管部口或指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权将学位论文在学校图书馆保存并允许被查阅。有权自行或许可他人将学位论文编入有关数据库提供检索服务。有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。研究生签名：患后Ｔ时罔：

5、年６月３日气＾义’导师签養：时间日了今＾：年名月＾摘要本研究以抑制绵羊肌肉生长抑制素（MSTN）的功能为出发点，通过制备MSTN纳米抗体，探究一条有效促进动物肌肉生长的新途径。利用噬菌体展示技术表达绵羊MSTN纳米抗体基因文库，经过四轮亲和淘选(Panning)获得MSTN高特异性的纳米抗体片段，利用大肠杆菌表达MSTN纳米抗体并分离纯化，在细胞水平和小白鼠动物试验中验证MSTN纳米抗体对肌肉生长作用的影响。主要研究方法与结果如下：1、绵羊MSTN的诱导表达，确定ELISA包被抗原用量。利用I

6、PTG在大肠杆菌中诱导表达MSTN成熟肽蛋白并纯化，通过ELISA和Westernblot方法检测抗原反应原性，优化亲和淘选包被抗原蛋白的浓度。2、绵羊MSTN纳米抗体的淘选和鉴定。扩繁M13K07噬菌体侵染原始文库，构建噬菌体展示抗体文库，噬菌体文库容经滴度测定达到1.8×1012pfu/mL。利用重组MSTN蛋白抗原对噬菌体抗体库进行富集、筛选，经过4轮亲和淘选，获得了一株亲和力高、特异性强的阳性克隆，测序后经BLAST比对分析证实该克隆序列为骆驼单域重链抗体序列。3、MSTN纳米抗体在大肠杆菌中诱导

7、表达与鉴定。利用PCR克隆出目的抗体基因序列，构建两种原核表达载体，转化大肠杆菌后经IPTG诱导表达，表达产物经HIS镍柱纯化重组抗体，经ELISA和Westernblot验证其与MSTN抗原结合的亲和活性和特异性。4、MSTN纳米抗体对小白鼠生长效果研究。通过MTT细胞计数法验证其对成肌细胞C2C12无毒性作用。实验分组对小白鼠肌肉定量注射纳米抗体，比较各试验组小白鼠体重增长变化，对试验小白鼠肌肉组织切片和免疫荧光观察其肌肉形态学变化和MSTN蛋白表达量变化情况。结果表明纳米抗体可以明显促进小白鼠的体重

8、增长，注射纳米抗体的小白鼠肌纤维横截面积高于未注射纳米抗体组和对照组，表明MSTN纳米抗体对肌肉生长具有明显促进作用。综上所述，本研究通过四轮亲和淘选成功筛选到驼源绵羊MSTN纳米抗体，并利用大肠杆菌成功表达重组MSTN纳米抗体，其对肌肉细胞无毒性，能够有效促进小白鼠肌肉生长。该项研究为研发抗体促生长生物制剂提供了候选材料。关键词：肌肉生长抑制素；纳米抗体；原核表达；生长效果IAbstractInordertoexplorea